Les oxydes nitriques Doxorubicines s’accumulent dans les cellules cancéreuses du côlon humain résistantes à la doxorubicine induisant une cytotoxicité

La résistance multiple aux médicaments (MDR) est l’une des principales raisons de l’échec de la chimiothérapie anticancéreuse. Parmi les mécanismes qui sous-tendent ce phénomène, nous connaissons le mieux ceux qui augmentent la capacité des cellules cancéreuses à évacuer les médicaments anticancéreux, limitant ainsi leur accumulation cellulaire avec une réduction conséquente de la toxicité; cette forme de MDR est l’une des plus étudiées dans les modèles de cellules cancéreuses.1,2 En effet, les cellules cancéreuses sont capables de surexprimer les protéines transporteurs de la cassette de liaison ATP (ABC), qui sont les produits d’une famille de 49 gènes. ABC B1, mieux connue sous le nom de P-glycoprotéine (P-gp) ou MDR1, et ABC C1 − 6, mieux connues sous le nom de protéines MRP1 − 6, sont les pompes les plus représentatives impliquées dans MDR.3 Un des les stratégies suivies pour inverser MDR est la co-administration d’un agent anticancéreux avec un inhibiteur de ces pompes d’efflux. Elacridar, tariquidar et laniquidar sont des exemples d’inhibiteurs de troisième génération qui ont été étudiés dans des essais cliniques en association avec un certain nombre de médicaments antitumoraux.4,5 L’identification de nouveaux agents anti-MDR ciblant sélectivement les cellules résistantes aux médicaments est un domaine de Dans la lignée de cellules du côlon épithéliales humaines résistantes à la doxorubicine (DOXO) HT29-dx, il existe une relation entre la production réduite d’oxyde nitrique endogène (NO) et la résistance de ces cellules à l’antibiotique.7 Les donneurs de NO classique, tels que La S-nitrosopénicillamine (SNAP), le nitroprussiate de sodium (SNP) et la S-nitrosoglutathione (GSNO) ont pu réduire l’efflux de DOXO des cellules HT29-dx7. Cet effet n’a pas été inhibé par l’ODQ (1H- [1,2 , 4] oxadiazolo [4,3-a] quinoxalin-1-one), un inhibiteur bien connu de la guanylate cyclase soluble (sGC), ou par l’inhibiteur de la protéine-G kinase 8-bromoguanosine-3 ′ # x02032; -monophosphorothioate cyclique (Rp-8-Br-cGMPS), ni mimé par 8-bromoguan monophosphate cyclique (8-Br-cGMP), indiquant ainsi une indépendance vis-à-vis du monophosphate cyclique de guanosine-3 & ggr; (GMPc). Des expériences réalisées avec SNAP ont montré que dans les cellules HT29-dx, la nitration des résidus tyrosine de MRP3 s’est produite, suggérant ainsi que la nitration du transporteur est un mécanisme possible d’inversion de résistance. De plus, les dérivés du furoxane (1,2-oxadiazole-2-oxydes), connus pour libérer le NO sous l’action des cofacteurs thiol, peuvent inhiber les transporteurs de la P-gp et de la MRP1 dans le MDK (Madin − Darby canine rein). -MDR1 et -MDRP1, respectivement, avec une augmentation de l’accumulation cellulaire de DOXO lorsqu’ils sont co-administrés avec l’antibiotique.9 Des expériences réalisées avec des dérivés de 3-phénylsulfonylfuroxane, les inhibiteurs les plus puissants de la série, ont montré que ces produits étaient capables de nitrer résidus de tyrosine de P-gp, qui dans cette forme est probablement incapable d’évacuer l’antibiotique. D’autres études rapportent qu’un apport réduit en oxygène pourrait induire une MDR dans les cancers solides et que la MDR induite par l’hypoxie pourrait être inversée par de faibles concentrations de NO mimétiques.10,11 En utilisant ces bases comme point de départ, nous avons décidé de synthétiser de nouveaux dérivés semisynthétiques DOXO dans lesquels l’antibiotique a été joint par une liaison ester à des fragments contenant des sous-structures 3-phénylsulfonylfuroxane ou nitrooxy, vu la capacité potentielle de ces produits à déclencher action anticancéreuse combinée à une capacité réduite à induire une résistance. Comme mentionné précédemment, le système furoxane peut libérer du NO sous l’action de thiols endogènes. En revanche, la libération de NO à partir de nitrates organiques se produit par catalyse enzymatique. Un certain nombre d’enzymes ont été proposées pour cette conversion; en particulier, le rôle de l’aldéhyde mitochondriale déshydrogénase (mtALDH) et des enzymes P-450 a été souligné.12 − 14 Les résultats préliminaires obtenus en étudiant les produits 4 et 5 (NO − DOXO) (graphique 1) Les figures 4 et 5 ont été préparées à partir d’un mélange de bromhydrate de 14-bromo et de 14-chlorodaunorubicine 1 par réaction avec de l’acide 4- (2,3-dinitrooxypropyl) benzoïque 2 et 3. L’acide [(3-phénylsulfonyl) furoxan-4-yloxy] propanoïque 3 dans l’acétone, respectivement. Après purification par chromatographie éclair, les produits ont été isolés sous forme de chlorhydrates. Les esters méthyliques simples 6 et 7, utilisés à titre de comparaison, ont été préparés en traitant 2 et 3 dans du méthanol au reflux, en présence de H2S04 (voir l’information justificative). Les cellules HT29-dx ont été incubées en milieu RPMI 1640 avec DOXO et NO # x02212; DOXO (4 et 5) à différentes concentrations (0,5 − 25 μ M) pendant 24 h. A la fin de cette période, les antibiotiques ont été dosés sur le lysat cellulaire, en utilisant une méthode de spectrofluorimètre avec λ émission 553 nm et λ excitation 475 nm. A ces longueurs d’onde, les spectres de DOXO, 4 et 5 étaient superposables (données non présentées). Les résultats, rassemblés sur la Figure 1, montrent que les DOXO NO2 s’accumulent dans les cellules d’une manière dépendante de la concentration, contrairement à DOXO, dont la concentration intracellulaire n’augmente pas de manière significative, sauf à la concentration la plus élevée (25). μ M). Cet effet était plus accentué pour le dérivé de furoxane 5 que pour le dérivé nitrooxy 4 et a été inversé (Figure 3A) (Figure 3A) 3A) par co-incubation avec le 2-phényl-4,4,5,5-tétraméthylimidazoline-1-oxyle. -oxyde (PTIO) et globules rouges, choisis comme pièges à NO efficaces (Figure ​ (Figure 3C) .3C). Le prétraitement avec les dérivés de phénylsulfonylfuroxane 3 ou 7 a augmenté l’accumulation intracellulaire de DOXO (voir les informations de support). L’ester 7 était plus puissant que l’acide simple correspondant 3, très probablement en raison de la perméabilité différente des composés. En outre, la co-incubation de 3 et 7 avec DOXO a augmenté l’accumulation de l’antibiotique dans les cellules (voir les informations de support). En outre, ces expériences indiquent clairement que le phénomène dépend de NO. Figure 1: accumulation dose-dépendante de DOXO et de NOX dans les cellules HT29-dx. Les cellules ont été incubées pendant 24 h en l’absence ou en présence de différentes concentrations (0,5, 1, 2,5, 5 et 25 μ M) de DOXO (colonnes ouvertes), 4 (colonnes hachurées), ou 5 (.. Figure 3Effets des capteurs de NO sur l’accumulation et les toxicités de DOXO et de NOx et les cellules de HT29-dx ont été incubées en l’absence (−) ou en présence (CTRL) de 5 μ M DOXO, 4 ou 5 pendant 24 h; lorsque cela est indiqué, 100 μ M PTIO (PT) ou 10 μ L / mL … De même, les DOXO augmentent leur accumulation en fonction du temps: élévation de l’intracellulaire le contenu de 5 μ M antibiotiques est devenu significatif après 1 h pour 5 et après 3 h pour 4 et n’a jamais été significatif entre 1 et 24 h pour DOXO (données non montrées) .Ce comportement est parallèle à la cinétique d’efflux de drogue de HT29-dx En effet, lorsque les monocouches de cellules ont été chargées avec différentes quantités des trois médicaments (solutions M) pendant 10 min et ensuite la teneur intracellulaire de l’antibiotique a été examinée spectrofluori métriquement sur les lysats cellulaires recueillis après 10 et 20 min, les résultats décrits sur la figure  Les valeurs Vmax mesurées classent l’ordre DOXO (8,38 ± 0,38 nmol du médicament transporté / min / mg prot) > 4 (4,23 ± 0,18 nmol du médicament transporté / min / mg prot) > 5 (2,65 ± 0,09 nmol du médicament transporté / min / mg prot), ce qui montre que l’efflux de DOXO diminue considérablement par rapport à l’antibiotique simple.Figure 2 Cinétique d’échappement de DOXO et DOXOs de NO x02212; à partir de cellules HT29-dx. Des cellules HT29-dx ont été chargées dans du tampon PBS pendant 10 minutes à 37 ° C avec différentes quantités (1 − 200 μ M) de DOXO (cercle ouvert), 4 (carré ouvert) ou 5 ( carré solide), puis … En conséquence de ce comportement, la toxicité des DOXO est définitivement plus élevée que celle de DOXO.En effet, lorsqu’elles sont incubées avec des solutions de DOXO à 5% M, les cellules présentent une augmentation significative de la libération de la lactate déshydrogénase (LDH), un indice sensible de la toxicité d’un médicament, par rapport à DOXO seul (Figure 1). ​ (Figure3B) .3B). Le niveau de LDH était plus élevé pour le dérivé de furoxane 5 que pour le produit 4 substitué par un nitrooxy. Dans les deux cas, la toxicité était réduite en présence de PTIO de piégeage de NO et de globules rouges. En revanche, aucune augmentation significative des taux de LDH n’a été observée avec les acides simples 2 et 3, utilisés pour obtenir les deux co-médicaments 4 et 5, et les esters méthyliques apparentés 6 et 7. Cette constatation indique que l’effet cytotoxique est dû à l’anthracycline pharmacophore plutôt qu’aux fractions libérant NO.Pour déterminer si les DOXO sont capables de restaurer la production de NO dans les cellules HT29-dx, les solutions de 4 et 5 de concentration différente (0,5 − 25 μ M ) ont été incubés avec des monocouches cellulaires pendant 24 h, et le nitrite dans le milieu de culture a ensuite été quantifié par réaction de Griess. Les résultats rapportés dans la figure 44 montrent que la production de nitrite dépend de la concentration et qu’elle est maximisée pour le dérivé de furoxane 5. La libération de nitrite dépendait du temps: l’utilisation d’une solution 5 + M des antibiotiques, un augmentation significative de nitrite a été détectée après 1 h avec 5 et après 3 h avec 4, mais restait non significative entre 1 et 24 h avec DOXO (données non montrées). Figure 4Dose-dépendante production de nitrite dans les cellules HT29-dx traitées avec DOXO et NO − DOXOs. Les cellules ont été incubées pendant 24 h en l’absence ou en présence de différentes concentrations (0,5, 1, 2,5, 5 et 25 μ M) de DOXO (colonnes ouvertes), 4 (colonnes hachurées), … On sait que les pompes d’efflux de médicament P-gp et MRP3 sont surexprimées dans les cellules HT29-dx.7 Pour vérifier si la capacité de 4 et 5 à s’accumuler dans ces cellules pourrait être due à la nitration des résidus tyrosine de ces pompes d’efflux, les produits, les cellules HT29-dx ont été incubées pendant 24 h avec les deux antibiotiques ou avec DOXO. Le lysat cellulaire entier a été immunoprécipité avec un anticorps antinitrotyrosine spécifique, et les protéines immunoprécipitées ont été soumises à un transfert Western, en utilisant des anticorps anti-P-gp et anti-MRP3 (Figure 5) .5). La présence de résidus nitrotyrosine était détectable sur la protéine MRP3 dans les cellules HT29-dx incubées avec 4 ou 5 mais pas avec DOXO seul. Un certain nombre d’espèces réactives de l’azote, générées dans différentes conditions et environnements, peuvent médier cette nitration. La quantité de nitro-tyrosine produite par 5 est apparue supérieure à celle produite par 4. Ce résultat est en accord avec les niveaux plus élevés de nitrite détectés avec 5. De plus, l’accumulation intracellulaire de DOXO avec 5 était plus élevée qu’avec 4. On sait que DOXO régule à la hausse l’isoforme inductible de la NO synthase (iNOS) 15, augmentant ainsi la synthèse endogène de NO dans les cellules de mammifères. Ainsi, il est possible que la nitration de MRP3 induite par 4 et 5 soit due en partie à la libération de NO par les produits et en partie à la production accrue de NO endogène via l’induction de l’enzyme iNOS. Aucune nitration n’est survenue dans la protéine P-gp. La P-gp et MRP3 sont toutes deux impliquées dans l’efflux de DOXO, en fonction des différents tissus et de l’abondance relative des transporteurs dans les cellules tumorales.3 Le traitement avec les composés donneurs de NO 3 et 7 n’a pas modifié l’activité de la P-gp dans les cellules HT29-dx (voir le test de la rhodamine 123 dans les Informations de Support), nous devons conclure que ce transporteur ne joue pas de rôle principal dans l’effet exercé par NO sur la rétention de DOXO. Ceci est probablement dû au nombre plus faible de résidus de tyrosine du transporteur par rapport à MRP3 et / ou à son expression inférieure.7,16 Figure 5Nitration des pompes d’efflux de médicament par DOXO et DOXO dans les cellules HT29-dx. Les cellules HT29-dx ont été incubées pendant 24 h avec 5 DOXO, 4 ou 5 fois. Ensuite, les cellules ont été lysées et le lysat cellulaire entier a été immunoprécipité avec un antinitrotyrosine … Les résultats préliminaires présentés dans le présent travail montrent que la conception de médicaments antitumoraux hybrides donneurs de NO pourrait être une stratégie utile pour traiter le problème de la MDR dans le traitement du cancer.