Large prévalence d’anticorps anti-grippaux humains largement neutralisants hétérotubes

Voir le commentaire éditorial de Donis et Cox, pages – Contexte Le manque d’immunité à vie contre les virus grippaux représente un problème de santé mondial majeur avec de profondes conséquences médicales et économiques Une meilleure compréhension de l’anticorps humain neutralisant « hétérosubtypique » à large spectre BnAb Méthodologie Des échantillons de sérum prélevés sur des volontaires dans une étude de vaccin anti-HN ont été analysés pour les anticorps anti-réactifs contre les hémagglutinines de sous-type HAS et une poche hautement conservée sur la tige HA des virus du groupe. Les anticorps dans des immunoglobulines intraveineuses commerciales ont été purifiés par affinité en utilisant des billes couplées H puis par compétition d’anticorps monoclonaux par étapes ou élution acide. Des tests immuno-enzymatiques ont été utilisés pour quantifier les liaisons croisées et l’activité de neutralisation a été déterminée avec des virus HA pseudotypés. avoir leve détectable ls de l’activité de liaison HA hétérosubtypique aux virus du groupe et de la grippe A, y compris les sous-types H et H, auxquels les sujets de l’étude n’avaient pas été vaccinés Deux populations différentes de BnAbs neutralisantes ont été purifiées à partir d’immunoglobulines intraveineuses par des billes H: l’immunoglobuline G totale peut se lier aux HA des deux groupes et neutraliser les virus HN et HN; Ces données – à notre connaissance, pour la première fois – montrent quantitativement la présence, quoique à de faibles niveaux, de deux populations de BnAbs hétérosubtypiques contre la grippe A dans le sérum humain. Ces observations justifient un examen plus approfondi afin de déterminer leur origine, les polymorphismes de l’hôte qui peuvent affecter leurs niveaux d’expression et la façon de stimuler ces réponses BnAb par la vaccination pour atteindre des niveaux de protection durables.

La grippe reste un problème médical majeur et constitue une menace constante pour la santé humaine. De la grippe A, la grippe A est généralement associée à une maladie plus grave et est sous-typée par les protéines de surface, hémagglutinine HA et neuraminidase. les groupes phylogénétiques et les sous-types NA définissent tous les sous-types de virus grippaux A Les sous-types HA du groupe sont H, H, H, H, H, H, H, H, H et H; les sous-types HA du groupe sont H, H, H, H, H et H Les virus saisonniers, tels que le groupe A HN et le groupe HN, et les virus influenza B provoquent une infection chez% – -% de la population mondiale et -, En plus des épidémies annuelles fréquentes, les virus grippaux provoquent périodiquement des pandémies, l’exemple le plus récent étant la pandémie causée par le virus HN / influenza d’origine porcine. La vaccination est le principal moyen de prévention de la grippe saisonnière et pandémique. Récemment, nous et d’autres avons identifié une famille d’anticorps humains «hétérosubtypiques» largement neutralisants BnAbs qui se lient à une poche hautement conservée sur la tige de HA présente dans tous les groupes. virus de la grippe et de bloquer la fusion de virus de la cellule hôte-cellule Ces BnAbs ont été identifiés par recombinaison H panning à partir de banques anticorps Ab-phage qui sont constru des cellules B non immunitaires , des cellules B mémoire d’immunoglobuline Ig M de vaccinés saisonniers , ou de moelle osseuse de survivants « oiseaux-grippes » infectés par HN Des BnAbs ayant des propriétés similaires ont également été récupérés à partir de mémoire immortalisée cellules de vaccinés saisonniers Un résultat inattendu de ces études est la contribution fréquente des gènes de la chaîne lourde VH à ces AcNB, suggérant qu’une grande partie jusqu’à% du répertoire des cellules B naïves humaines a la capacité de répondre à cet épitope conservé Ces observations soulèvent des questions supplémentaires quant à savoir si ces BnAbs sont présents dans le sérum humain et à des niveaux «protecteurs», s’ils existent comme des anticorps «naturels» et / ou s’ils sont générés pendant la réponse immunitaire à l’infection grippale ou vaccination Pour explorer ces questions, nous avons analysé des échantillons de sérum de vaccinés HN et d’immunoglobulines intraveineuses intraveineuses IVIG pour leur activité de liaison croisée et de neutralisation contre différents sous-types de grippe A Nous avons également utilisé un BnAb représentatif, F, pour lequel l’épitope précis a été déterminé par cristallographie , pour sonder les BnAb hétérosubtypiques dirigées contre la poche hautement conservée sur la tige HA

Méthodes

Cohorte de vaccination

Des échantillons sériques de volontaires sains, appariés avant et après la vaccination – mois, ont été collectés et stockés dans un centre unique, à partir d’un essai clinique dose-escalade ClinicalTrialsgov Identifiant: NCT sur un vaccin HN inactivé, mené à l’Institut national des allergies et infectieux Maladies, National Institutes of Health Le vaccin fabriqué par Sanofi Pasteur utilisé dans l’essai était un vaccin monovalent, inactivé sous -virion HN rgA / Vietnam // XA / PR // L’étude a été menée conformément au protocole approuvé par le comité d’examen institutionnel. dosages immuno-enzymatiques Des tests ELISA ont été réalisés pour tester la réactivité croisée des échantillons sériques contre de multiples sous-types de la grippe A Protéines HA recombinantes, y compris HA / New York // HN, H-NY, HA / Aichi / HN, HA /, HA / Vietnam // HN, H-VN, et HA / Pays-Bas / HN, H-NL, ont été exprimés dans des cellules d’insectes en tant que trimères d’ectodomaines HA Les protéines HA ont été enduites sur une plaque Maxisorb ELISA Nunc à μg / mL en phosp. PBS saline tamponnée hate à ° C pendant la nuit La plaque a été lavée avec du PBS pour enlever les protéines non enrobées. Des échantillons de sérum dilués en série ont été appliqués sur les plaques revêtues de HA, suivis de Peroxydase HRP anti-humaine IgG ou IgM Pierce Biotechnology. La densité optique à nm a été mesurée après incubation du système substrat de peroxydase tétraméthylbenzidine. Un test ELISA de compétition a été réalisé pour déterminer le niveau d’Ab de type F dans les échantillons de sérum F Ab IgG humaine a été biotinylé avec Sulfo-NHS-SS-biotine Pierce Biotechnology conformément aux instructions du fabricant Biotinylated F Bio-F; ng / mL a été mélangé à: vol ratio avec des échantillons de sérum à diverses dilutions et ajouté à des plaques ELISA revêtues de trimère H-VN La compétition des échantillons sériques pour la liaison de Bio-F à H a été déterminée en mesurant la liaison restante de Bio- F en utilisant HRP-Streptavidin BD Bioscience

Groupe IVIG

Isoler les Ab liés au H et les Abs de type F par les immunoglobulines IVIG intraveineuses; mg / ml, Gamunex IVIG; Talecris Biothérapeutique, nous avons d’abord immobilisé les protéines H-VN sur des billes magnétiques Dynabeads M-Epoxy; Invitrogen conformément au manuel du fabricant, puis a utilisé la bio-élution par étapes et l’élution acide pour séparer les Abs-like et les H-bound liés présents dans l’IVIG Spécifiquement, × des billes H ont été incubées avec des mL d’IgIV mg / ml pendant une nuit à ° C, lavé abondamment avec% BSA / PBS, suivi d’une élution de Bio-F μg / ml, ml, total μg pendant une nuit à ° C. Les Ab liés H restants sur les billes H ont ensuite été isolés avec de l’acide élution pH =; tampon, perles de μL / H Ensuite, les éluants Bio-F et les éluants acides ont été incubés avec des billes de Strep-T μL de billes; Invitrogen à ° C pendant – h chaque fois pour et fois, respectivement ELISA a été effectuée pour vérifier que le Bio-F dans les deux échantillons a été complètement enlevé après Absorption des billes Strep-T Les Ac purifiés H-Ab et F-like, ainsi que Les IgIV non purifiées ont été quantifiées par ELISA en utilisant comme standards des concentrations connues de mAb monoclonal F. La procédure de purification mentionnée ci-dessus a été augmentée proportionnellement pour obtenir suffisamment d’ABS et d’analogues de type F pour tester leur réactivité croisée contre différents sous-types de grippe A par ELISA Des analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le test t apparié pour comparer les niveaux de liaison Ab et postvaccination et les activités d’inhibition de Bio-F Ab. L’activité de neutralisation a été comparée à l’aide du test de microneutralisation logarithmique MN Titres Les proportions de l’augmentation du niveau d’Ab par rapport au pli ont été comparées par le test de McNemar pour les résultats binaires appariés. Toutes les valeurs P étaient -idées, et P v alues ​​& lt; ont été considérés comme statistiquement significatifs La corrélation entre les IgG de type F et le titre de MN contre le HN dans les échantillons de sérum postvaccination n = a été analysée par l’analyse du coefficient de corrélation de rang de Spearman

RÉSULTATS

Dans le groupe vaccin HN, les IgM pré-vaccinales contre la protéine recombinante H-VN étaient détectables chez la majorité des sujets de l’étude. Le taux de liaison aux IgM a augmenté significativement après la vaccination P =; Cependant, seulement% des sujets ont démontré une augmentation de ____ multiplié par une augmentation de la densité optique à nm par ELISA. Figure A Tous les sujets de l’étude avaient des anticorps IgG pré-immuns liés à H-VN Figure B Comme prévu, la liaison à H-VN P & lt; La figure B et l’activité de neutralisation MN titre contre HN la souche vaccinale; P & lt; La Figure E a significativement augmenté après la vaccination IgG anti-HA / protéine recombinante Figure C et protéine H-NL La Figure D a également été détectée dans les échantillons de sérum pré-immun Contrairement à la liaison H, la liaison IgG postvaccination à H n’a pas augmenté significativement. ; cependant, il a augmenté pour atteindre une signification statistique pour H P & lt; , mais la proportion d’échantillons avec une augmentation de la liaison de H> était significativement plus faible que celle de la liaison de H par rapport à%; P & lt;

H-VN Des échantillons de sérum dilués en série ont été mélangés avec ng / ml de Bio-F et appliqués sur des plaques ELISA revêtues de H La compétition sérique pour la liaison de Bio-F à H a été déterminée en mesurant la liaison restante de Bio-F en utilisant HRP-Streptavidine. L’activité de compétition sérique est représentée par le pourcentage d’inhibition. Pour tous les panels à l’exception du panel E, les données à la dilution sérique représentative sont représentées comme suit: panel A,:; panneau B,:; panneaux C et D,:; et panneau F,: Pour tous les panneaux, les données sont montrées dans un graphique en boîte et en moustaches. La boîte s’étend du percentile au percentile avec une ligne à la médiane. Les moustaches au-dessus et au-dessous indiquent respectivement les percentiles th et th. Les points au-dessus et au-dessous des moustaches sont des points de données au-delà du th et du percentile. Vue d’ensemble des échantillons de sérum pré et postimmune appariés de HN vaccinés A-D, dosages immuno-enzymatiques ELISA Des échantillons de sérum ont été dilués en série et appliqués à H Les plaques ELISA revêtues de -VN-A et B, HA / -CH ou H-NL-D et la fixation des immunoglobulines IgM ou IgG dans des échantillons sériques aux protéines HA de l’hémagglutinine ont été déterminées en utilisant l’anticorps anti-HRP-anti-humain secondaire. IgG B – -D Les niveaux de liaison sont indiqués en tant que densité optique à nm OD E, titrage de microneutralisation MN titre contre le virus HN; Les échantillons de sérum pré- et post-immun de HN ont été testés pour leur activité de compétition contre un BnAb, F, se liant à H-VN Des échantillons de sérum dilués en série ont été mélangés avec ng / mL Bio-F et appliqué aux plaques ELISA revêtues de H La compétition sérique pour la liaison de Bio-F à H a été déterminée en mesurant la liaison restante de Bio-F en utilisant HRP-Streptavidin L’activité de compétition sérique est exprimée en pourcentage d’inhibition Pour tous les panels à l’exception du panel E, les données à la dilution sérique représentative sont indiquées comme suit: panel A,:; panneau B,:; panneaux C et D,:; et panneau F,: Pour tous les panneaux, les données sont montrées dans un graphique en boîte et en moustaches. La boîte s’étend du percentile au percentile avec une ligne à la médiane. Les moustaches au-dessus et au-dessous indiquent respectivement les percentiles th et th. Les points situés au-dessus et au-dessous des moustaches sont des points de données au-delà des percentiles th et th. Pour étudier davantage la présence de BnAbs hétérosubtypiques dans le sérum, nous avons sondé des échantillons sériques pour détecter la présence d’anticorps IgG de type F Bio-F à H-VN dans un test ELISA de compétition Nous avons trouvé que des anticorps de type F pouvant entrer en compétition pour la liaison Bio-F étaient également présents dans des échantillons de sérum de prédaccination, avec% d’échantillons démontrant une inhibition de la liaison Bio-F à : dilution Figure F De plus, les titres d’IgG de type F augmentent significativement après la vaccination P & lt; De plus, il existe une corrélation faible mais significative entre les IgG de type F et le titre de MN contre le HN dans les échantillons de sérum post-immun, tel que déterminé par l’analyse de corrélation de rang de Spearman. efficace =; cependant, ces BnAbs dirigés sur des poches de tige n’atteignent pas des niveaux suffisamment élevés pour rendre une corrélation fortement significative. Pour déterminer si ces BnAbs étaient uniques à la population testée ou sont plus largement présentes, nous avons quantifié les Ac anti-H et F dans IgIV commerciale et déterminé leur ampleur de l’activité de liaison et de neutralisation hétérosubtypique Les IgIV contenaient des IgG groupées provenant de milliers de donneurs et sont représentatives de la composition d’IgG pré-immune dans la population générale Bien qu’il ne puisse être formellement exclu que les IgIV soient vraiment naïves, c’était l’échantillon le mieux représentatif disponible pour cette étude. Des billes magnétiques H-immobilisées ont été utilisées pour purifier par affinité les anticorps F-like et anti-H des ABS-like. Les Ig ont été isolés par élution par compétition Bio-F des billes H totales. Par l’ELISA quantitatif, nous avons trouvé que, à partir de mg d’IgIV, ~ μg d’ABS lié au plateau recouvert de H Les rendements finaux étaient de – μg d’anti-H élué à l’acide. L’élution compétitive Bio-F a donné ~ μg d’anticorps de type F. par mg d’IgIV ~% du taux total d’Ig et avec une efficacité de récupération similaire ou supérieure à l’élution acide. Ces anticorps anti-H et F ont été testés pour leur activité hétérosubtypique de liaison et de neutralisation d’HA contre le groupe et les virus. les anticorps anti-H élués ne sont pas spécifiques du sous-type H: ils ont montré une activité de liaison croisée à H-NY, à HA / et faiblement à H-NL Figure A-D; ils ont neutralisé à la fois HN A / Thaïlande / -SP- /, H-TH et HN A / Caroline du Sud // HN, H-SC virus pseudotypé Figure E-F Bio-F éluée F-like Abs, a montré une spécificité de groupe comme prévu et lié à H et H Groupe I, mais pas à H et H Groupe II Figure A-D; ils ont également neutralisé à la fois les pseudovirus HN et HN Figure E-F

Figure Vue largeDownload slideHétérosubtypique des anticorps contre les virus de la grippe dans les immunoglobulines intraveineuses IVIG H-VN a été immobilisé sur des perles H-billes magnétiques et les billes ont été utilisées pour purifier l’anticorps Abs anticorps de l’échantillon IVIG F-like Abs et les Abs liés H étaient purifié séparément, les anticorps de type F ont été purifiés par élution de compétition Bio-F suivie de multiples étapes d’absorption des billes de streptavidine pour éliminer complètement Bio-F. Les Ab liés H restants sur les billes H ont été élués avec une méthode d’élution acide standard suivie d’une Absorption de Bio-F en utilisant Streptavidin-billes aussi bienUn dosage immuno-enzymatique ELISA détectant Bio-F a été utilisé pour confirmer qu’aucun Bio-F résiduel n’est resté dans Bio-F-élué ou les échantillons élués à l’acide L’activité de liaison de ces On a mesuré l’ABS purifié à H-NY A, H-VN B, HA / C et H-NL D par ELISA à différentes concentrations diluées en série. L’activité de neutralisation de ces échantillons a été mesurée à l’aide de neutraliza essai de diagnostic avec des virus pseudotypés de H-E et H-TH F; R a été utilisé comme anticorps monoclonal de contrôle négatif spécifiquement contre la protéine spike du syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus OD, densité optique à nmFigure View largeTélécharger slideHétérosubtypique des anticorps contre les virus grippaux A dans les immunoglobulines intraveineuses IVIG H-VN a été immobilisé sur des billes magnétiques -les perles et les perles ont été utilisées pour purifier les anticorps anticorps Les anticorps Abs de l’échantillon IVIG Les anticorps F-like et les Abs H restants ont été purifiés séparément Les anticorps F-like ont été purifiés par élution par compétition Bio-F suivie de plusieurs étapes de streptavidine-billes Absorption pour éliminer totalement Bio-F Les Ab liés H restants sur les billes H ont été élués avec la méthode d’élution acide standard suivie d’une absorption complète de Bio-F en utilisant des billes Streptavidin ainsi qu’un dosage immuno-enzymatique ELISA détectant Bio-F. utilisé pour confirmer qu’aucun Bio-F résiduel n’est resté dans les échantillons élués au Bio-F ou dans les échantillons élués à l’acide. L’activité de liaison de ces Abs purifiés à H-NY A, H-VN B, H-A / C et H-NL D ont été mesurés par ELISA à différentes concentrations diluées en série. L’activité de neutralisation de ces échantillons a été mesurée en utilisant un test de neutralisation avec des virus pseudotypés de H-E et H-TH F; R a été utilisé comme mAb de contrôle négatif qui est spécifiquement contre la protéine de pointe du syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus OD, densité optique à nm

DISCUSSION

Les autres chercheurs ont montré qu’un faible taux d’anticorps anti-HA hétérotypiques qui lient et neutralisent les virus HN est présent dans les IgIV provenant de diverses régions géographiques, ce qui inclut les personnes susceptibles d’être infectées par le virus A de la grippe saisonnière. Ces études ont en outre montré que ces anticorps anti-HN hétérosubtypiques réagissent de manière croisée avec HN et HN; Nos données montrent qu’il existe des populations d’anticorps hétérosubtypiques avec différentes capacités de liaison aux HA dans les IgIV: on peut se lier aux HA des virus du groupe et du groupe; l’autre est spécifiquement dirigé contre la poche de la tige du groupe Approximativement% d’IVIG provenant très certainement de donneurs H- et H-naïfs, qui est purifié par élution acide des billes H, a une activité de liaison hétérosubtypique aux HA du groupe et du groupe. Abs ont également démontré une activité neutralisante contre les virus pseudotypés HN et HN Les anticorps dirigés vers la poche de tige F-like ont également été détectés dans IVIG et ont été récupérés à ~% des taux de liaison H Abs. et les profils de neutralisation parmi les HA testés et les virus comme mAbs spécifiques du groupe qui sont dirigés vers la poche de la tige de HA [, -] Pour les deux fractions Ab, une plus large gamme d’autres sous-types n’a pas été testée. purifier à partir de IgIV ~ μg et μg / mg IVIG, respectivement, purification à grande échelle de la protéine H et d’autres matériaux seront nécessaires pour caractériser ces BnAbs hétérosubtypiques plus en détail Bien q montrent que les BnAbs qui se lient au groupe et aux HA sont présents à des niveaux très bas, et que les BnAbs de type F dirigés vers la poche existent à des niveaux encore plus bas, la question de savoir si le sérum ou les IgIV ont des niveaux protecteurs de l’un ou l’autre type hétérosubtypique BnAbs n’est pas répondu dans notre étude Cependant, nos données quantitatives soutiennent la notion que les niveaux de ces BnAbs sont des titres limites ou inférieurs qui seraient traditionnellement considérés comme protecteurs Par exemple, il y a jusqu’à μg d’Abs-like F / mg IVIG; en supposant IgG mg / mL dans le sérum humain normal, alors des concentrations allant jusqu’à μg / ml d’Ac-F pourraient être présentes. De même, la fraction acide BnAbs éluée avec des activités contre les Groupes pourrait aussi être dans cette gamme. dans ces niveaux dans notre étude patients Figure, et il reste possible que les facteurs de l’hôte, y compris le polymorphisme VH, peuvent influer sur les niveaux de base et inductibles BnAb En outre, les origines de ces populations d’anticorps anti-HA hétérosubtypiques sont inconnues. être un composant des anticorps polyréactifs «naturels» ne peut être exclu Cependant, il est fort probable que nos sujets de l’étude du vaccin HN et les donneurs d’IgIV aient déjà été exposés à d’autres virus de la grippe HN du groupe HN et du / ou une infection naturelle, et cela peut avoir donné naissance à des anticorps hétérosubtypiques de liaison H et H, respectivement. En résumé, nos résultats montrent que le système immunitaire humain est capable de faire BnAb s-non seulement à la poche conservée sur la tige HA des virus du groupe, mais aussi à d’autres épitopes inconnus qui sont partagés par les virus du groupe et de la grippe A. Ces observations fournissent la base pour d’autres investigations visant à mieux comprendre ces BnAbs, leurs Ces études supplémentaires devraient nous rapprocher de l’élaboration d’un vaccin universel contre la grippe qui offre une protection durable au-delà des vaccins saisonniers et atténue la capacité des virus à se neutraliser. Le schéma thérapeutique vaccinal – qui a induit un niveau de protection des BnAbs dirigés contre la poche du groupe chez l’animal – fournit des preuves expérimentales qu’il en est de même chez l’homme Financement Ce projet a été financé en totalité ou en partie avec des fonds fédéraux Institut de l’allergie et des maladies infectieuses, Institut national de la santé U-AI; Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les points de vue ou les politiques du ministère de la Santé et des Services sociaux, et la mention de noms commerciaux, de produits commerciaux ou d’organisations n’implique pas l’approbation des États-Unis. Genetech / Roche a reçu de Genentech / Roche une part des redevances de brevets versées à son institution pour le brevet sous licence qui couvre des anticorps tels que le F utilisé dans l’étude RL et LB ont bénéficié d’une subvention, Le NIH WCH et J Sheehan ont reçu un soutien du NIH par le biais de leurs institutions Tous les autres auteurs: no conflicts