Découverte de INCB3284, un antagoniste du hCCR2 puissant, sélectif et oral disponible

Les macrophages, dérivés des monocytes, un sous-ensemble de leucocytes, sont des médiateurs bien caractérisés de la destruction tissulaire. Ces cellules peuvent être activées pour sécréter des cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF α et IL-1 &#x003b2 ;, enzymes dégradant les tissus tels que les MMP et autres chimiokines qui médient l’influx d’autres cellules inflammatoires.1 Le recrutement excessif de ces cellules aux sites d’inflammation conduit à une destruction tissulaire significative et contribue à la morbidité chronique. maladies inflammatoires et auto-immunes. On pense que le trafic des monocytes / macrophages vers les sites inflammatoires est principalement médié par la protéine chimioattractive monocytaire-1 (MCP-1, CCL2) par interaction avec son récepteur spécifique, CCR2, qui est un membre de la super famille des sept-transmembranaires Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont majoritairement exprimés sur les monocytes. La liaison de MCP-1 à CCR2 induit une chimiotaxie, entraînant une migration dirigée des monocytes / macrophages vers des sites pathologiques où l’expression de MCP-1 est élevée.2 Des études sur des modèles de rongeurs ont démontré le rôle critique de MCP-1 / CCR2 dans les maladies inflammatoires et auto-immunes et suggèrent fortement que CCR2 est une cible thérapeutique attrayante3. En conséquence, l’inhibition du CCR2 est apparue comme une nouvelle approche thérapeutique pour la recherche pharmaceutique, et un certain nombre de puissants antagonistes du CCR2 à petites molécules ont été identifiés. 4 Nous avons signalé la découverte d’une nouvelle série d’antagonistes du CCR2 grâce à un design rationnel.10 Nos études de structure et d’activité sur cette série de composés ont conduit à l’identification de l’INCB3344 (figure ​ (figure1), 1), un antagoniste puissant, sélectif et biodisponible de la CCR2 humaine et murine. (hCCR2 et mCCR2). L’INCB3344 a été utilisé comme outil pour la validation des cibles chez les rongeurs en raison de son activité inhibitrice puissante envers le CCR2 murin, de sa sélectivité par rapport aux autres récepteurs homologues des chimiokines et de son bon profil pharmacocinétique mais ne convenait pas comme candidat clinique. activité (IC50 = 13 μ M) telle qu’évaluée en utilisant un test de liaison au dofétilide, qui ne répondait pas à nos critères d’activité de liaison à hERG. En outre, INCB3344 était un inhibiteur de CYP3A4.Figure 1Structure de INCB3344.Dans le cadre des études SAR sur la série INCB3344 dans une tentative d’identifier un candidat clinique, nous avons découvert que l’élimination de l’éthoxy en position 3 sur la pyrrolidine dans la série INCB3344 comme dans 1 (Figure ​ (Figure2) 2) a entraîné une perte significative de l’activité de mCCR2 mais a conservé l’activité de hCCR2 comme dans 2 (Figure ​ (Figure2) .2). Une configuration R en position 3 sur la pyrrolidine comme indiqué en 2 est nécessaire pour l’activité en tant que l’énantiomère S de 2 présente une CI50 de > 1 μ M dans l’essai de hCCR2 MCP-1. Bien que cette série des-éthoxy ne soit pas supérieure à la série INCB3344 par comparaison de 2 avec 1 dans l’activité de hCCR2 et l’activité de liaison de hERG, le noyau de pyrrolidine 1,3-disubstitué dans cette série offre un avantage sur le 1,3,4-trisubstitué D’un point de vue synthétique, le noyau de pyrrolidine de la série INCB3344, comme la structure de noyau précédente, (R) -3-aminopyrrolidine, a un seul centre chiral et est disponible dans le commerce, tandis que la dernière structure de base, trans-4-amino-3- l’éthoxypyrrolidine, a deux centres chiraux et n’est pas disponible dans le commerce. Ces considérations nous ont incités à prendre 2 comme composé principal pour les modifications. Comme l’INCB3344, 2 présentait une activité de liaison dofétilide hERG modérée avec une CI50 de 13,2 μ M, qui dépassait nos critères. Parce que 2 a un cLogP de 4,08, nous avons pensé que l’activité de liaison de hERG modérée de 2 pourrait être attribuée à l’hydrophobicité de la molécule. Bien que l’impact sur la liaison CCR2 ne puisse pas être prédit, si le cLogP est diminué, il est probable que l’activité de hERG pourrait être réduite, 11,12 Le haut cLogP de 2 est attribué aux deux anneaux phényle hydrophobes sur la main gauche et les côtés droits. Nos études SAR précédentes avaient démontré que le résidu trifluorométhylphényle sur le côté droit est critique pour l’affinité de liaison CCR2. Pour cette raison, nous avons ciblé le résidu phényle sur le côté gauche pour les modifications dans une tentative d’augmenter la polarité de la molécule. Les calculs de cLogP ont révélé que le cLogP de 2 peut être considérablement abaissé si le résidu phényle sur le côté gauche est remplacé par un cycle hétéroaromatique tel qu’un pyridyle (cLogP = 2,09). Ainsi, des études SAR en position 4 du cyclohexyle ont été effectuées en remplaçant le cycle phényle par différents cycles hétéroaryles. Les hétérocycles que nous avons étudiés comprennent la pyridine, la pyrimidine, la pyridazine et la pyrazine. Comme le montre le tableau 1, les trois régioisomères de pyridyle ont présenté une activité hCCR2 similaire et, plus important encore, étaient des antagonistes de hCCR2 très puissants avec de faibles activités nanomolaires dans les essais de MCP-1 et de chimiotaxie, démontrant la tolérabilité d’un cycle hétéroaromatique polaire. en position 4 du cycle cyclohexyle pour l’activité de hCCR2. Comme attendu, ces analogues polaires présentaient une faible activité de liaison à hERG, avec une CI50 de M, satisfaisant à nos critères pour passer aux criblages pharmacocinétiques de souris (PK). Administré par voie orale à des souris, l’analogue de pyridine-2-yle 3 a été bien absorbé, avec une ASC élevée de 2812 nM à une dose de 10 mg / kg, tandis que l’analogue de pyridine-3-yle 4 et la pyridine L’analogue -4-yl 5 présentait des taux sanguins très bas à la même dose. L’excellent profil PK de 3 nous a incités à effectuer un test de patch-clamp. De façon décevante, il présentait une inhibition de 57% du courant de potassium hERG à une concentration de 10 μ M (IC50 < 10 μ M), ce qui ne répondait pas à nos critères (IC50 > 10 μ M) dans l’activité de pansement patch hERG pour un candidat clinique.Tableau 1Hétéroaryl Analogues 3 − 14Par comparaison avec les analogues pyridyl 3 − 5, les analogues hétéroaryliques contenant deux azote 6   une activité hCCR2 plus faible dans les dosages de la MCP-1 et de la chimiotaxie (tableau 1). L’analogue de pyrimidin-5-yl n’était pas assez puissant dans l’activité de CCR2, alors que les analogues de pyrimidin-2-yl (6) et de pyrazin-2-yl (11) étaient juste assez puissants pour répondre à nos critères (IC50 < 10 nM dans des dosages de MCP-1 et de chimiotaxie) pour un profilage plus poussé.Du fait que les composés 6 et 7 et 9 "11 présentaient une activité de liaison au dofétilide hERG faible (IC50 > 30 μ M), ils ont été soumis à des criblages PK chez la souris. Des taux plasmatiques élevés ont été observés pour les deux composés de pyrimidine 6 et 7 et le composé de pyrazine 11, tandis que les deux composés de pyridazine 9 et 10 ont été mal absorbés chez les souris. Lorsqu’ils ont été soumis à des tests de clampage, 6, 7 et 11 ont manifestement montré une faible inhibition du courant de potassium hERG dépression. Les 7 et 11, qui ne présentaient qu’une inhibition de 7% à une concentration de 10 M dans le test de pansement de hERG, représentaient les deux premiers composés de cette série avec une bonne absorption orale chez les souris et une faible inhibition ( < 10% à 10 μ M) du courant de potassium hERG.Pour obtenir un aperçu de la grande différence dans l'exposition orale entre l'analogue 2-pyridyl 3 et l'analogue 3-pyridyl 4, des études ADME ont été réalisées sur 3 et 4 et a révélé que 4 avait une perméabilité beaucoup plus faible et une N-oxydation plus profonde à l'azote pyridyle que 3 (données non montrées). Nous avons pensé que ces différences pouvaient être attribuées à l'effet stérique sur l'azote pyridyle. L'azote pyridyle en 3 est protégé stériquement par le résidu cyclohexyle. En revanche, l'azote pyridylique en 4 est plus exposé avec un impact probable sur la perméation transcellulaire et une susceptibilité accrue à l'oxydation par rapport à l'azote 2-pyridyle. Pour protéger l'azote pyridyle en 4 contre la solvatation et l'oxydation, nous avons introduit un groupe méthyle en position 6 du pyridyle pour fournir 12. Cette modification a maintenu la puissance du hCCR2 et la faible activité de liaison à hERG mais a entraîné une légère amélioration exposition, avec seulement 2,5 fois dans la zone sous la courbe (AUC). Il est probable que le groupe méthyle ne soit pas assez volumineux pour protéger l'azote pyridylique de la solvatation et de l'oxydation. En revanche, l'introduction d'un groupe méthoxy en position 6 du pyridyle dans 4 pour fournir un résidu pyridyle moins basique a non seulement maintenu la puissance du hCCR2 et la faible activité de liaison du dofétilide, mais a amélioré l'exposition orale d'une ASC de 50 nM. h à 10 mg / kg dans 4 à une ASC de 617 nM · h à la même dose dans 13, une augmentation de 12 fois. Quand il est soumis à un essai de clampage, remarquablement, le composé 13 présente seulement 7,7% d'inhibition du courant potassique hERG à une concentration de 10%, représentant un autre puissant antagoniste CCR2 avec une exposition orale acceptable chez les souris concurrentes à une faible activité hERG ( < 10% à 10 μ M) dans le test patch clamp. L'augmentation de la longueur du groupe alcoxy en 13 en remplaçant le méthoxy par l'éthoxy (14) a maintenu l'activité du hCCR2 mais a abouti à un niveau sanguin plus bas (AUC = 287 nM) à 10 mg / kg chez la souris. profil dans une combinaison de puissance hCCR2, d'absorption orale chez la souris et d'activité de clamp-clamp hERG, le composé 13 (INCB3284) a été sélectionné pour d'autres évaluations in vitro et in vivo. INCB3284 est un antagoniste de hCCR2 puissant avec des valeurs IC50 de 3,7 nM dans l'antagonisme de la liaison de MCP-1 à hCCR2 et de 4,7 nM dans l'antagonisme de l'activité de chimiotaxie. Il a inhibé de manière puissante les événements de signalisation médiés par CCR2 tels que la mobilisation intracellulaire du calcium et la phosphorylation de ERK avec des valeurs IC50 de 6 et 2,6 nM, respectivement. Les criblages de Cerep ont révélé que INCB3284 est un inhibiteur sélectif de CCR2, ne présentant aucune activité inhibitrice significative à une concentration de 1 μ M lorsqu'il est testé contre un panel de 50 canaux ioniques, transporteurs, récepteurs de chimiokines comprenant CCR1, CCR3, CCR5 , CXCR3 et CXCR5, et GPCR supplémentaires. Dans le test de clamp clamp hERG, INCB3284 a inhibé le courant potassique hERG avec une CI50 de 84 &numsp &numsp &numsp M. En ce qui concerne la liaison protéique, INCB3284 présentait une fraction libre élevée (58%) dans le sérum humain à des concentrations de 1 et de 10% M. Lorsqu'il était incubé avec des microsomes hépatiques humains, INCB3284 présentait une clairance intrinsèque modérée. Cependant, des études avec des isoenzymes CYP recombinantes ont montré que INCB003284 est un substrat pour CYP3A4 et CYP2D6. Le CYP3A4 recombinant a métabolisé INCB003284 au niveau de la liaison N C entre l'azote pyrrolidine et le carbone cyclohexyle en son métabolite N-désalkylé, tandis que le CYP2D6 recombinant a métabolisé INCB3284 au niveau de la liaison O du groupe méthoxy entre le méthyle et le 6. -hydroxypyridyle oxygène au métabolite des-méthyle. Lorsque INCB3284 a été incubé avec S9 humain avec ou sans NADPH et le cofacteur glutathion, aucun adducts de glutathion n'a été détecté. INCB003284 n'est pas un inhibiteur du CYP, avec des valeurs IC50 de > 25 μ M contre cinq isozymes CYP CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 et CYP3A4. INCB3284 n’est pas un inducteur du CYP à des concentrations allant jusqu’à 10 μ M tel que mesuré dans le dosage luminométrique de la luciférase. La pharmacocinétique de INCB3284 a été étudiée chez le rat, le chien, le singe cynomolgus et le chimpanzé (Tableau 2).Après l’administration intraveineuse d’INCB3284, la clairance systémique totale était élevée chez les rats, mais faible chez les chiens, les singes cynomolgus et les chimpanzés. Le volume apparent de distribution à l’état d’équilibre (Vss) a suivi la même tendance que dans la clairance, avec un Vss élevé chez les rats et un Vss faible chez les chiens, les singes cynomolgus et les chimpanzés. Par conséquent, l’INCB003284 avait une demi-vie courte à modérée après administration intraveineuse allant de 2,2 à 3,8 h. Administrée par voie orale, une demi-vie similaire a été observée chez les rats et les chiens, tandis qu’une demi-vie légèrement plus longue a été atteinte chez les singes et les chimpanzés. La biodisponibilité orale variait de 13% chez les singes cynomolgus à 31% chez les chiens.Tableau 2Pharmacokinetic paramètres de INCB003284As décrites dans le schéma 1, cette série de composés ont été synthétisés à partir de la (R) -1-benzyl-3-aminopyrrolidine 15 disponible dans le commerce. Le couplage de 15 avec le dérivé de glycine 16 en utilisant du chloroformiate d’isobutyle suivi par l’élimination du groupe benzyle par hydrogénation produit l’intermédiaire pyrrolidine 18. Une amination réductrice de 18 avec de la cyclohexanone 4,4-disubstituée 19 en utilisant du triacétoxyborohydrure de sodium en tant qu’agent réducteur fournit les composés finaux comme un mélange de deux isomères avec un rapport d’environ 3: 2. Les deux isomères ont été séparés par chromatographie sur gel de silice. Les isomères majeurs ont été caractérisés par RMN comme étant des isomères trans avec l’hydroxyle en position 4 sur le cyclohexyle trans au résidu pyrrolidin-1-yle en position 1 sur le cyclohexyle et étaient les isomères actifs 3 ⾾ 14. Les isomères cis étaient inactifs (< inhibition de 50%) à une concentration de 1 μ M dans le test MCP-1. La stéréochimie au cyclohexyle a été confirmée par cristallographie aux rayons X sur le sel d'acide tartrique de 3. La structure cristalline aux rayons X a révélé que le cyclohexyle adopte une conformation de chaise avec la pyridin-2-yle en position équatoriale et l'hydroxyle et la pyrrolidine. 1-yl dans les positions axiales. Il n'y a pas de liaison hydrogène intramoléculaire formée entre le proton hydroxyle et l'azote pyridyle dans la structure cristalline car le groupe hydroxyle et l'azote pyridyle sont situés dans les directions opposées sur le plan du cyclohexane.Structure 1Synthesis of Compounds 3 − la synthèse de l'intermédiaire cétonique 19 est présentée dans le schéma 2A. La lithiation d'un bromohétérocycle (non) substitué (R-Br, 20) en utilisant du n-butyllithium à − 78 ° C, suivie de l'addition de 1,4-cyclohexanedione mono-éthylène cétal 21, a donné naissance au cétal. intermédiaire 22. Le traitement de 22 avec du HCl aqueux a converti le cétal en la cétone correspondante 19. Pour certains des hétérocycles, les hétérocycles bromés-substitués n'étaient pas disponibles dans le commerce ou la lithiation des bromohétérocycles n'a pas produit les produits désirés. Pour ces raisons, d'autres voies de synthèse ont été développées comme indiqué dans le schéma 2B & D x. La 4-hydroxy-4- (pyrimidin-4-yl) cyclohexanone 19a et la 4-hydroxy-4- (pyrazin-2-yl) cyclohexanone 19b ont été préparées à partir de 5-bromopyrimidine 23 (Schéma 2B) et de 2,6-dichloropyrazine 25 (Schéma 2C), respectivement. Un traitement de 23 ou 25 avec du diisopropylamidure de lithium (LDA) suivi d'une trempe avec 21 a fourni le cétal contenant du brome 24 ou le cétal contenant du chlore 26. Hydrogénation en présence de triéthylamine pour éliminer le brome en 24 ou chlore en 26 suivi d'acide un traitement pour hydrolyser le cétal a fourni les cétones 19a et 19b. Les deux dérivés de pyridazine 19c et 19d ont été préparés à partir de la pyridazine 27 (Schéma 2D). Le traitement de 27 avec du 2,2,6,6-tétraméthylpipéridinide de lithium suivi de l'addition de 21 a donné lieu à un mélange de deux régioisomères 28a et 28b. Après séparation par chromatographie, les deux isomères ont été traités avec de l'acide pour donner les cétones 19c et 19d correspondantes. Synthèse des cétones L'amination réductrice pour produire INCB3284 à partir de sa cétone 19e correspondante et de l'intermédiaire pyrrolidine 18 a été étudiée de manière approfondie. On a découvert que le rapport 3: 2 de l'isomère trans (INCB3284) par rapport à l'isomère cis obtenu en utilisant le triacétoxyborohydrure de sodium comme agent réducteur pouvait être amélioré à 4: 1 lorsque l'amination réductrice était réalisée par hydrogénation en présence d'oxyde d'aluminium en utilisant palladium sur carbone comme catalyseur. Sans chromatographie, l'isomère trans (INCB3284) pourrait être enrichi à un rapport de trans: cis = 98: 2 par cristallisation du produit brut avec l'acide méthanesulfonique. Le sel cristallin obtenu a été alcalinisé avec NaOH, et la base libre résultante a été soumise à une autre cristallisation en utilisant de l'acide méthanesulfonique, donnant un sel cristallin pur de bismesylate INCB3284 (Schéma 3) .Synthèse 3Synthèse de BISSIBATE INCB3284 En résumé, nous avons pris 2 comme composé principal pour modifications afin d'optimiser son activité hERG modérée. Des études SAR ont été réalisées sur le côté gauche en 2 en remplaçant le cycle phényle par une variété de cycles hétéroaromatiques, conduisant à l'identification de 13 (INCB3284).L'INCB3284 présentait un profil équilibré d'activité hCCR2 puissante, de sélectivité élevée, d'activité hERG faible, de fraction libre élevée en liaison protéique et de biodisponibilité orale acceptable chez les rats, les chiens, les singes cynomolgus et les chimpanzés, répondant à nos critères pour un candidat clinique. Le profil d'innocuité toléré des études toxicologiques BPL chez les rongeurs et les primates a justifié son avancement dans les essais cliniques humains. Les études cliniques de phase I et de phase II ont révélé que l'INCB3284 présentait un profil pharmacocinétique adapté à une administration quotidienne (T1 / 2 = 15 h).