Comparaison des procédures de diagnostic en laboratoire pour la détection de Mycoplasma pneumoniae dans les foyers communautaires

ContexteMycoplasma pneumoniae continue d’être une cause importante de pneumonie acquise dans la communauté CAP Une méthodologie plus définitive pour une détection fiable de M pneumoniae est nécessaire pour identifier les épidémies et prévenir les complications extrapulmonaires potentiellement mortelles Méthodes Nous avons analysé les poussées de PAC dues au pneumoniae M et à l’écouvillon oropharyngé Des échantillons et des sérums ont été prélevés chez des sujets cliniquement définis, des contacts familiaux et des individus asymptomatiques. La réaction en chaîne par polymérase en temps réel PCR pour M pneumoniae a été réalisée sur tous les échantillons sur écouvillon et l’utilité diagnostique a été comparée à celle des tests sérologiques disponibles dans le commerce. Le% et le% ont donné des résultats positifs avec les tests sérologiques Immunoglobuline M et Immunoglobuline G / Immunoglobuline M, respectivement. Pour les non cancéreux,% ont donné des résultats positifs avec la PCR en temps réel, alors que% et% a donné une résolution sérologiquement positive La sensibilité de la PCR en temps réel a diminué à mesure que la durée entre l’apparition des symptômes et la collecte des échantillons augmentait, avec une sensibilité maximale de% aux jours. Une spécificité de% pour l’immunoglobuline M Une analyse des données a révélé qu’aucun test unique disponible n’était fiable pour l’identification d’un foyer de PAC dû à M. pneumoniae. Une combinaison de méthodes d’essai a été prouvée. être l’approche la plus fiable pour l’identification des foyers de PAC dus à M pneumoniae, en particulier en l’absence d’autres pathogènes respiratoires suspectés

On estime que Mycoplasma pneumoniae est responsable de% -% des cas de pneumonie acquise dans la communauté. CAP La plupart des infections sont légères ou asymptomatiques et souvent spontanément résolvables; Cependant,% -% des infections peuvent nécessiter une hospitalisation et peuvent entraîner des complications extrapulmonaires graves, telles qu’une encéphalite Des éclosions d’infection à M pneumoniae se produisent dans des établissements scolaires, pénitentiaires, hospitaliers et communautaires. Méthodes fiables et rapides de confirmation l’étiologie de telles éclosions est nécessaire pour permettre une réponse efficace de santé publique. Plusieurs méthodes diagnostiques détectent l’infection à M pneumoniae, y compris l’isolement, la fixation du complément, les tests sérologiques et les tests de détection moléculaire Chacune de ces méthodes a ses limites. Les tests de fixation du complément manquent de sensibilité et de spécificité Les tests sérologiques disponibles dans le commerce pour la détection des anticorps dirigés contre M pneumoniae présentent des limites inhérentes de spécificité et de sensibilité et, plus important encore, dépendent du respect du patient. l’acquisition en temps opportun d’aigus et convalescents- Des échantillons de sérum de phase pour une interprétation précise Les tests moléculaires, tels que la PCR en temps réel, ont récemment montré qu’ils facilitaient l’identification rapide des foyers d’infection à M pneumoniae et offraient une plus grande sensibilité que les méthodes traditionnelles De plus, la fiabilité de ces tests de diagnostic est souvent compliquée par les défis inhérents aux enquêtes sur les flambées d’étiologie inconnue, par exemple, la collecte d’échantillons appropriés et le transport pour les tests. Nous avons évalué un test de PCR en temps réel récemment validé et des kits de détection sérologique largement disponibles pour leur fiabilité dans la détection de l’infection à M pneumoniae lors de récentes épidémies de PAC. ] L’isolement a également été tenté pour tous les écouvillons échantillons avec un résultat de PCR en temps réel positif

Méthodes

Au cours de l’enquête sur les éclosions d’infection à M pneumoniae à l’université et dans la collectivité, des prélèvements oropharyngés et / ou rhinopharyngés sur écouvillon et des sérums ont été obtenus à la même date pour chaque individu des groupes: pneumonies confirmées radiologiquement ou cliniquement, avait récemment demandé l’avis d’un médecin pour une toux, des contacts familiaux d’individus symptomatiques, et des personnes appariées à l’âge sans maladie ou symptômes Les cas ont été définis comme température de la fièvre, ⩾ ° C et toux ou diagnostics cliniques ou radiologiques de pneumonie Les contacts asymptomatiques de cas ou de sujets témoins appariés selon l’âge ont été considérés comme des patients non-cas. Les plaquettes ont été placées en mL de milieu de transport viral BD universel Becton-Dickinson, SP ou PBS et ont été transportées à ° C ou ont été congelés Des échantillons de sérum ont été prélevés sur un sous-ensemble de ces patients et ont été transportés à ° C ou ont été congelés. Seuls les individus qui ont fourni à la fois L’extraction totale des acides nucléiques a été effectuée sur tous les échantillons sur écouvillon, conformément aux instructions du fabricant, en utilisant des kits: le kit QIAamp DNA Blood BioRobot MDx Qiagen, le kit QIAamp DNA Blood Mini Qiagen, ou le kit d’isolement d’acide nucléique total MagNA Pure LC Les échantillons de Roche Applied Science Swab ont été vortexés dans le milieu de transport viral avant l’extraction de l’échantillon. Le volume restant de chaque échantillon a été congelé à – ° CA test PCR en temps réel spécifique à M pneumoniae. un essai de RNase P comme témoin pour l’extraction et l’intégrité de l’échantillon a été effectué en double sur tous les échantillons extraits, comme décrit ailleurs Des échantillons de sérum ont été testés pour la présence d’anticorps contre M pneumoniae en utilisant Mycoplasma ImmunoCard Meridian Bioscience; ci-après dénommé « test Meridian IgM » et le système de test d’anticorps IgG / IgM de Mycoplasma pneumoniae Remel; ci-après dénommé « test Remel IgG / IgM » selon les instructions du fabricant. On a tenté d’isoler tous les échantillons sur écouvillon positifs à la PCR. On a placé 200 ul de chaque surnageant en ml de milieu SP avec du glucose. Un deuxième μL de chaque surnageant a été filtré à travers un filtre à seringue de -μM et a été traité comme ci-dessus. Tous les tubes ont été incubés à ° C avec% CO avec un tube témoin négatif contenant le milieu seulement. Des passages aveugles ont été effectués chaque semaine pendant des semaines Les tubes avec changement de couleur du support ont été extraits et testés par le test PCR en temps réel décrit pour confirmer la présence de M pneumoniae. La sensibilité diagnostique, la spécificité et la valeur prédictive positive pour un cas cliniquement défini et non casé ont été calculés pour chaque procédure de laboratoire logiciel SAS, version SAS Institute, a été utilisé pour ces calculs

Résultats

Un total d’individus ont été testés pour la présence de M pneumoniae par PCR en temps réel et par les tests IgM de Meridian et IgM / IgM Remel de ces personnes, avaient des cas cliniquement définis, et ont été classés comme patients non-cas. résultats de sensibilité pour tous les tests de diagnostic Vingt patients ont eu des résultats positifs de la valeur de seuil de croisement moyen de la PCR en temps réel [Ct],; ,% ont eu des résultats positifs du test Meridian IgM, et% ont eu des résultats positifs du test Remel IgG / IgM. Les personnes ayant des résultats positifs de PCR en temps réel ont systématiquement obtenu des résultats positifs pour Meridian IgM% et Remel IgG / IgM% données de titrage non montrées Parmi les patients ayant des résultats de PCR en temps réel négatifs,% ont eu des résultats positifs pour le test Meridian IgM, et% ont eu des résultats positifs pour les tests IgM / IgM Remel non montrés. par PCR en temps réel a également donné des résultats positifs des tests Meridian IgM et Remel IgG / IgM

Tableau View largeTélécharger la diapositiveDiagnostic de la sensibilité et de la spécificité de la PCR en temps réel, IgM-spécifique Mycoplasma ImmunoCard Meridian Bioscience; ci-après dénommé test Meridian IgM, et le système de test d’anticorps IgG / IgM de Mycoplasma pneumoniae Remel; ci-après dénommés résultats Remel IgG / IgM pour les patients et les non-patients, selon l’âge et l’intervalle entre l’apparition des symptômes et la collecte des échantillonsTable View largeDownload slideDiagnostic sensibilité et spécificité de la PCR en temps réel, IgM Mycoplasma ImmunoCard Meridian Bioscience ci-après dénommé test Meridian IgM, et le système de test d’anticorps IgG / IgM de Mycoplasma pneumoniae Remel; ci-après appelés résultats Remel IgG / IgM pour les patients et les non-patients, par âge et intervalle entre l’apparition des symptômes et la collecte des échantillons. Les isolats ont été récupérés à partir de% de spécimens PCR positifs, y compris les échantillons obtenus Bien que le test Meridian IgM ait semblé être la méthode la plus sensible étudiée, il avait aussi la plus faible spécificité. Le test Remel IgG / IgM était une spécificité plus spécifique,% mais était la moins sensible des méthodes Bien que la sensibilité pour la PCR en temps réel n’était que de%, elle avait le plus haut taux de spécificité% En outre, la PCR en temps réel avait la valeur prédictive positive la plus élevée%, avec les IgM Meridian et Remel IgG / IgM démontrant des valeurs prédictives positives de% et de%, respectivement La valeur prédictive positive de la PCR en temps réel était significativement plus élevée que celle du test Meridian IgM P & lt; et le test Remel IgG / IgM P & lt La sensibilité diagnostique et la spécificité de chaque procédure de laboratoire ont varié selon l’âge et l’intervalle, en jours, depuis l’apparition des symptômes jusqu’à la collecte des échantillons. & lt; La spécificité du test Meridian IgM était de% chez les sujets âgés de – ans et de% chez les sujets âgés, mais elle a augmenté à% chez les personnes âgées de ⩾ ans Bien qu’il n’y ait pas eu de différence statistiquement significative dans la spécificité pour les groupes d’âge – ans et – ans, il était significativement plus élevé pour la spécificité relative des groupes d’âge de ⩾ ans par rapport aux groupes d’âge; % CI, – Aucune différence de spécificité liée à l’âge n’a été trouvée pour le test Remel IgG / IgM ou la PCR en temps réel. La sensibilité diminuait avec l’âge pour les deux tests anticorps mais augmentait avec l’âge pour la PCR en temps réel.

Figure Vue largeDownload slidePourcentage de spécimens de sérum testés positifs pour Mycoplasma pneumoniae à l’aide de Mycoplasma ImmunoCard Meridian Bioscience spécifique aux IgM; A ou le système de test d’anticorps IgG / IgM de Mycoplasma pneumoniae Remel; B, par groupe d’âge, parmi les patients et les patients non-patientsFigure View largeTélécharger la diapositivePourcentage de spécimens de sérum positifs pour Mycoplasma pneumoniae utilisant l’immunoglobuline Mycoplasma ImmunoCard spécifique à l’IgM Meridian Bioscience; A ou le système de test d’anticorps IgG / IgM de Mycoplasma pneumoniae Remel; L’analyse des données de PCR en temps réel a montré que la sensibilité diminuait à mesure que l’intervalle entre l’apparition des symptômes et la collecte des échantillons augmentait. Pour des intervalles de – jours, la sensibilité était de%, mais elle diminuait à% pour les intervalles de – jours et à% pour les intervalles & gt; jours La sensibilité relative pour la PCR en temps réel était% CI, – pour les intervalles de – jours et% CI, – pour les intervalles de – jours où les deux étaient comparés avec les intervalles & gt; jours Contrairement à la tendance à la baisse de la sensibilité de la PCR en temps réel avec intervalle croissant, la sensibilité du test Meridian IgM a augmenté de% à% et de% à mesure que l’intervalle augmentait. tendance que l’intervalle a augmenté la table

Figure Vue largeDownload sensibilité de la PCR en fonction de l’intervalle entre l’apparition des symptômes et la collecte des échantillons Information pour calculer l’intervalle n’était pas disponible pour les patients Les barres d’erreur représentent les IC% pour la sensibilitéFigure View largeTélécharger la diapositiveRéaction PCR en temps réel en fonction de l’apparition des symptômes à la collecte des échantillons L’information pour calculer l’intervalle n’était pas disponible pour les patients Les barres d’erreur représentent les CI pour la sensibilité

Discussion

Ces approches tendent à être plus sensibles que la culture pour la détection de l’infection à M pneumoniae, les résultats doivent être interprétés avec prudence. La PCR en temps réel semble plus utile aux premiers stades de l’infection, lorsque plus d’organismes sont susceptibles d’être présents. la probabilité d’un résultat PCR positif diminue, car la sensibilité diminue significativement à mesure que l’intervalle entre l’apparition des symptômes et la collecte des échantillons augmente. Nos données suggèrent que la PCR est & gt; Ce principe est également démontré en analysant séparément les éclosions décrites dans cette étude. Dans un foyer, un intervalle moyen de jours s’est écoulé entre le début des symptômes et la collecte des échantillons, et le% de échantillons testés positifs par PCR en temps réel Ct,; dans l’autre, un intervalle moyen de jours écoulés, et% d’échantillons testés positifs par PCR en temps réel Ct; La qualité des échantillons, le stockage et les conditions de transport ont également un impact sur la performance de la PCR Collecte simultanée d’échantillons d’écouvillons oropharyngés et nasopharyngés et d’échantillons de sérum prélevés sur des échantillons prélevés sur des échantillons de sérum oropharyngés et / ou oropharyngés. les tests patients et les contrôles négatifs peuvent être des compléments utiles aux données de PCR en temps réel. Des tests pour d’autres agents pathogènes possibles doivent également être effectués, en particulier au début d’une investigation, car différents pathogènes respiratoires peuvent présenter le même tableau clinique. , doivent également garder à l’esprit lors de l’analyse des résultats Beaucoup exigent la collecte d’échantillons en phase aiguë et en phase de convalescence pour identifier une augmentation du titre suggérant une infection active Bien que les tests sérologiques peuvent fournir des informations rétrospectives importantes, la impossibilité d’obtenir le samp de suivi En outre, comme des études récentes l’indiquent, les anticorps IgM peuvent persister pendant des années, les taux restant élevés chez les individus asymptomatiques Nir-Paz et al ont constaté que les enfants en bonne santé vieillissent, Les résultats de notre étude corroborent ces résultats, car la spécificité du test Meridian IgM était plus faible pour les populations plus jeunes mais augmentait avec l’âge. Par conséquent, l’utilisation de tests sérologiques comme seul test peut fournir des informations trompeuses, car le taux élevé de positivité peut donner aux investigateurs et aux cliniciens la fausse impression que M pneumoniae est l’étiologie de l’épidémie de CAP. Cependant, nos données suggèrent que le test Meridian IgM pourrait être plus utile que le test Remel IgG / IgM pour identification précoce des éclosions d’infection à M pneumoniae et que toutes les données sérologiques sont plus utiles lorsqu’on compare les résultats pour les individus symptomatiques et les sujets asymptomatiques appariés à l’âgeUne des limites de notre étude est qu’un seul test sérologique sérologique a été utilisé pour chaque tests sérologiques, comme le recommandent la plupart des études Cette limite a toutefois été minimisée par la collecte et l’analyse de spécimens de sérum prélevés chez des patients non-cas afin d’établir une base de séropositivité parmi les différents groupes d’âge. patients, ils ont été en contact avec la famille ou ont fréquenté le même collège, ce qui peut avoir augmenté la probabilité d’infection asymptomatique ou d’immunité antérieure, conduisant à des taux de séropositivité plus élevés Cependant, une étude précédente évaluant la séropositivité chez les individus asymptomatiques cas patients dans notre étude Une deuxième limitation est que Il n’existe aucun test diagnostique standard qui rend difficile de tirer des conclusions pour déterminer la méthode la plus précise et la plus fiable pour identifier les spécimens positifs et négatifs. De plus, de nombreux laboratoires dépendent d’essais non standardisés et non validés et éprouvent parfois des difficultés à interpréter les résultats. La présente étude fournit un aperçu pour établir des stratégies de test optimales pour le diagnostic précis et en temps opportun de l’infection à M pneumoniae dans le contexte d’une flambée. Reconnaissance précoce, combinée avec une bonne collecte des échantillons, manipulation L’analyse des résultats des tests des poussées de CAP suggère qu’une combinaison de modalités de test spécifiques à M pneumoniae réalisées simultanément sur des cas suspects et des sujets témoins est la stratégie la plus fiable pour déterminer la présence de M pneumoniae. e l’étiologie d’une épidémie, en particulier en l’absence d’autres agents

Remerciements

Soutien financier Département de la santé et des services sociaux, Centres de contrôle et de prévention des maladies, Centre national de l’immunisation et des maladies respiratoires, Division des maladies bactériennes et des maladies respiratoires Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: aucun conflit