Charges d’ADN du virus d’Epstein-Barr chez des patients adultes infectés par un type d’immunodéficience humaine de type humain recevant un traitement antirétroviral hautement actif

Les patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine présentent un risque élevé de développer un lymphome associé au virus Epstein-Barr. Cependant, on sait peu de choses sur les charges d’ADN de l’EBV chez les patients recevant un traitement antirétroviral hautement actif. Nous avons démontré que beaucoup plus de patients infectés par le VIH recevant un traitement HAART que des volontaires non infectés par le VIH avaient un ADN EBV détectable dans le sang [%] vs [%] des patients; P = et la salive [%] de vs [%] des patients; P = Les charges EBV moyennes dans les échantillons de sang et de salive étaient également plus élevées chez les patients infectés par le VIH que chez les volontaires non infectés par le VIH P = La fréquence de détection du EBV dans le sang était associée à un nombre plus faible de CD. Des études supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si les cellules CD et CD spécifiques à l ‘EBV jouent un rôle dans la pathogenèse de l’ EBV chez les personnes infectées par le VIH, mais aucune différence n’a été observée dans les échantillons de sang ou de salive. patients infectés recevant un traitement HAART

Le virus Epstein-Barr EBV est un herpèsvirus humain omniprésent qui infecte la majeure partie de la population adulte mondiale. Un mode primaire de transmission est la salive, par laquelle le virus envahit la muqueuse oropharyngée et infecte les lymphocytes B, établissant la latence dans le compartiment B Des études antérieures à l’HAART suggéraient que les patients infectés par le VIH présentaient des charges génomiques EBV plus élevées dans les PBMC que les individus sains. En outre, les patients infectés par le VIH présentaient des quantités accrues d’EBV dans les sécrétions oropharyngées personnes séronégatives L’immunodéficience augmente le risque de certains types de cancer, en particulier les tumeurs qui sont étiologiquement liées aux agents viraux EBV est soupçonné de jouer un rôle majeur dans le lymphome non hodgkinien du SNC et le lymphome hodgkinien patients infectés, car la plupart de ces tumeurs contiennent de l’ADN EBV et expriment des gènes viraux EBV est également considéré comme un cofacteur dans le développement d’un sous-ensemble de cas L’introduction du HAART et la prophylaxie contre les maladies opportunistes ont significativement amélioré le taux de survie des patients infectés par le VIH Le traitement antirétroviral peut entraîner une diminution significative et durable du VIH périphérique. – Niveaux d’ARN, ainsi qu’une augmentation du nombre de cellules CD Cependant, l’influence de cette thérapie sur les malignités associées à l’EBV est moins claire Des données récentes provenant de différentes cohortes de patients adultes infectés par le VIH Les États-Unis et l’Europe occidentale n’ont montré aucune diminution significative de l’incidence des lymphomes LNH et hodgkiniens, contrairement aux réductions de l’incidence du sarcome de Kaposi et du LNH du SNC primaire chez les patients traités par HAART [, -] Une méta-analyse de Le cancer dans des cohortes sélectionnées de patients infectés par le VIH de la période allant de à la Collaboration internationale sur le VIH et le cancer a suggéré une légère diminution du taux de l lymphome mais aucune diminution des autres types de LNH systémique Cependant, il est important de souligner que l’analyse du LNH systémique est limitée par le manque d’informations pathologiques spécifiques de certaines des cohortes incluses dans la méta-analyse. En outre, une évaluation limitée L ‘incidence des syndromes lymphoprolifératifs systémiques chez les patients infectés par le VIH a été modifiée par l’ utilisation de HAARTData sur le fardeau d ‘EBV chez les patients infectés par le VIH recevant un traitement antirétroviral. Plus important encore, jusqu’à% des patients inclus dans ces études avaient des réponses virologiques et immunologiques discordantes à la multithérapie , suggérant une non observance du schéma thérapeutique ou l’émergence de souches VIH pharmacorésistantes. établir si les taux d ‘ADN de l’ EBV chez les patients recevant HAART étaient différents de ceux des individus non infectés par le VIH ou si les charges d ‘ADN de l’ EBV sont en corrélation avec La numération des cellules CD Les objectifs de la présente étude étaient d’évaluer quantitativement la fréquence de détection de l’ADN EBV dans les échantillons de sang et de salive prélevés chez des adultes infectés par le VIH et recevant un traitement antirétroviral HAART. volontaires non infectés, et de déterminer si les charges d’ADN EBV chez les patients infectés par le VIH sont en corrélation avec le nombre de cellules CD

Méthodes

une charge VIH-ARN de & lt; La multithérapie HAART a été définie comme inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse et comme inhibiteur de la protéase et / ou comme inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase inverse. Aucune infection opportuniste active n’a été détectée au cours de la multithérapie antirétrovirale. Les patients infectés par le VIH ont été exclus s’ils avaient eu une malignité active ou des antécédents de lymphome LNH ou Hodgkin Soixante-huit individus non infectés par le VIH sans aucun type de Les échantillons de sang et de salive ont été prélevés le jour de l’enrôlement pour chaque patient après avoir reçu le consentement éclairé. Cinquante millilitres de sang total ont été prélevés. dans des tubes de collecte d’acide-citrate-dextrose par ponction veineuse périphérique en utilisant un antiseptique techniques PBMC ont été obtenues après centrifugation différentielle à travers un tube ficoll-hypaque gradient Accuspin System-Histopaque- centrifugeuse; Sigma Les PBMC ont été aliquotes à × cellules / cryovial et granulés, et les granulés ont été stockés à – ° C échantillons de salive ont été obtenus à partir de bouchons de coton qui ont été mâchés par chaque individu pendant – min. faible vitesse; le liquide a ensuite été transféré aux cryotubes et stocké à – ° Ctraction et purification de l’ADN Tous les échantillons ont été traités dans une hotte à flux laminaire dans une installation BL exempte de virus et de plasmides au département de virologie moléculaire et de microbiologie du Baylor College of Medicine de Houston. L’ADN de PBMC a été préparé en utilisant un QIAmp Qiagen DNA Blood Mini-Kit conformément au protocole du fabricant Des échantillons de salive allant jusqu’à μL ont été traités en utilisant une procédure standard de protéinase K-phénol pour l’extraction d’ADN Les échantillons ont été incubés en ° C K Fisher, extrait au phénol: chloroforme et la phase aqueuse a été précipitée par précipitation à l’isopropanol. Les pastilles d’ADN ont ensuite été remises en suspension dans du tampon TE et stockées à – ° PCRR amplification et quantification de EBV DNA EBV a été détectée par PCR quantitative en temps réel. avec une sonde fluorogène, comme décrit ailleurs Des amorces et une sonde pour le gène EBER d’EBV ont été développées en utilisant un logiciel d’amorce express PE Applied Biosystems Les amorces directe et inverse EBER-FP / EBER-RP étaient ‘-TGACGTAGTCTGTCTTGAGGAGATG-‘ et ‘-CGTCTCCTCCCTAGCAAAACC-‘ La sonde fluorogène était VIC-TGCAAAACCTCAGGACCTACGCTGC-TAMRA La réaction PCR a été réalisée en utilisant un kit PCR Taqman PE Applied Biosystems In bref, ng d’ADN extrait des PBMC ou de la salive a été ajouté à un mélange PCR contenant mmol / L de Tris pH; mmol / L de KCl; mmol / L EDTA; mmol / L de MgCl; umol / L dATP, dCTP, dGTP et dTTP; μmol / L de chaque amorce; sonde fluorogène umol / L; N échantillons d’or AmpliTaq avec une quantité de modèle connu ont été exécutés pendant la réaction pour générer une courbe standard de Ct contre LogN NNote le nombre de copies original dans la norme Les standards ont été préparés en utilisant des cellules IB contenant des copies de génome EBV / cellule EBV On a utilisé des cellules DG négatives pour équilibrer toutes les normes jusqu’à une masse totale de ng. Une série de dilutions a été faite avec des quantités décroissantes d’ADN IB,,,,,, et ng. Ces quantités correspondent à ,, ,,,,, et copies de EBV, respectivement La limite de détection du test était de ~ EBV copies de ng d’ADN PBMC total En raison de la variabilité de l’ADN obtenu à partir d’échantillons de salive et comme confirmation de la qualité de l’échantillon, tous les échantillons ont également été testés pour l’amplification de la β-actine gène Les amorces et les conditions de PCR en temps réel de la β-actine ont été suivies selon les recommandations du fabricant. Charge appliquée de PE-BiosystemsHIV-ARN et numération CDcell La charge d’ARN-VIH dans le plasma a été mesurée par analyse quantitative ARN-PCR. y Amplicor VIH Monitor Test, Roche Diagnostics, qui a une limite inférieure de copies / ml, dans le cadre du suivi clinique pour les patients de la Thomas Street Clinic du district de Harris County Hospital. échantillons sanguins obtenus le jour de l’enrôlement par des techniques de cytométrie en flux standard Analyse statistique Les charges EBV ont été transformées en échelle logarithmique avant analyse. Valeurs inférieures à la limite de détection & lt; Les copies EBV par ng de PBMC total ou d ‘ADN salivaire ont été fixées, de sorte que la valeur logarithmique correspondait à ces valeurs. La corrélation entre la charge ADN EBV et le nombre de CD chez les patients infectés par le VIH recevant HAART a été déterminée selon les catégories établies par les centres. Les variables continues n’étaient pas normalement distribuées, donc un test non paramétrique a =

Résultats

Les caractéristiques démographiques et la numération leucocytaire des patients adultes infectés par le VIH et des volontaires non infectés par le VIH au moment de l ‘obtention des échantillons de sang et de salive sont présentées. Les âges moyens ± écart – types des groupes infectés et non infectés étaient similaires ± et ± Il n’y avait pas de différences significatives dans le nombre moyen de globules blancs, le pourcentage total de lymphocytes ou le nombre moyen de lymphocytes B chez les patients infectés par le VIH et les volontaires non infectés par le VIH. était de ± cellules / mm, – cellules / mm Quatre patients% avaient un nombre de cellules CD de & lt; cellules / mm, – cellules / mm Soixante et un pour cent des patients infectés par le VIH présentaient des charges de virus plasmatiques inférieures au niveau de détection, c’est-à-dire & lt; copies / mL, et les sujets% avaient une charge médiane de virus de copies / ml gamme, – copies / mL

Tableau View largeTélécharger les caractéristiques démographiques et les valeurs de laboratoire des patients adultes infectés par le VIH et des volontaires non infectés par le VIHTable View largeTélécharger les caractéristiques démographiques et de laboratoire des patients adultes infectés par le VIH et des volontaires non infectés par le VIHEBV ADN détecté par PCR de sang et échantillons de salive Les PBMC et échantillons de salive obtenus des deux groupes de patients ont été examinés par amplification PCR en utilisant des ensembles d’amorces spécifiques au gène EBV EBER. Les produits PCR EBER-FP / EBER-RP ont été générés à partir de PBMC provenant de patients infectés par le VIH. Les échantillons de salive prélevés sur des patients infectés par le VIH ont été exclus de l ‘analyse EBV car ils n’ont pas amplifié le gène β – actine. Les séquences EBV ont été détectées dans des échantillons de salive prélevés sur% des patients infectés par le VIH. et% des sujets séronégatifs Les taux moyens d ‘EBV dans les échantillons de PBMC et de salive chez les patients infectés par le VIH et le VIH – négatif les individus sont présentés dans le tableau

Tableau View largeTélécharger diapositiveEpstein-Barr virus EBV charge de l’ADN dans les PBMC et les échantillons de salive provenant de patients adultes infectés par le VIH et VIH-volontaires non infectésTable View largeTélécharger diapositiveEpstein-Barr virus Charges d’ADN EBV dans les PBMC et les échantillons de salive provenant d’adultes infectés par le VIH La fréquence de détection de l ‘ADN de l’ EBV dans les échantillons de sang prélevés chez des patients infectés par le VIH était significativement différente de celle observée chez les patients non infectés. Il est à noter qu’il y avait des différences significatives entre les charges moyennes d’EBV dans les échantillons de sang et les copies / ng d’ADN; P = et échantillons de salive contre copies / ng d’ADN; Corrélation entre les charges d’ADN de l’EBV et les numérations CDcell Parmi les patients infectés par le VIH et positifs à l’ADN EBV recevant un traitement antirétroviral, il y avait une augmentation significative du taux de détection de l’EBV dans le sang de ceux qui avaient un nombre de cellules CD de – cellules / mm, comparé à ceux qui avaient des comptes de cellules CD de & gt; cellules / mm table Cependant, lorsque les charges d’ADN EBV dans les PBMC ont été comparées par le nombre de cellules CD, aucune différence significative dans le nombre moyen de copies EBV par ng d’ADN PBMC n’a été observée parmi les groupes de patients. les échantillons de salive obtenus à partir de patients infectés par le VIH, par le nombre de cellules CD, ont été limités aux patients ayant un nombre de cellules CD – cellules / mm patients et & gt; cellules / mm patients, car seuls les patients avec un nombre de cellules CD de & lt; cellules / mm avaient un ADN EBV détectable Aucune différence significative dans la charge EBV moyenne dans les échantillons de salive n’a été observée chez ces patients par rapport à des copies / ng d’ADN; P =

Tableau View largeTélécharger slideEpstein-Barr virus EBV charges d’ADN, par le nombre de cellules CD, dans des échantillons de PBMC obtenus à partir de patients infectés par le VIH recevant HAARTTable View largeTélécharger diapositiveEpstein-Barr virus EBV charge ADN, par le nombre de cellules CD, dans les échantillons de PBMC patients infectés recevant un traitement HAART

Discussion

Cette étude a montré des charges élevées d’ADN EBV dans les PBMC et des échantillons de salive obtenus chez des patients infectés par le VIH, malgré la prise de HAART, des preuves de suppression du VIH et l’absence de tumeurs malignes EBV. Les patients infectés par le VIH que les volontaires séronégatifs positifs à l’ADN EBV, et le nombre de copies d’EBV détectées dans les échantillons de sang et de salive obtenus chez les personnes infectées par le VIH était significativement plus élevé que chez les personnes VIH-séronégatives. les taux de positivité et les charges d’ADN viral peuvent être liés à une surveillance immunitaire diminuée contre l’EBV pendant l’infection par le VIH, même chez les individus avec une réplication VIH indétectable et un nombre élevé de CD. Ceci est une découverte importante, car des données récentes indiquent que Chez les patients infectés avec un LNH systémique recevant un traitement HAART, les deux charges d’ARN-VIH étaient inférieures au niveau de détection et au nombre élevé de cellules CD. Dans ce même groupe d’étude, il y avait un Iso indique également que les patients infectés par le VIH recevant un traitement antirétroviral infecté par le VIH sont plus fréquemment expulsés, ce qui confirme l’idée que leur contrôle des infections virales n’est pas redevenu normal . Les résultats de la présente étude concordent avec un rapport récent suggèrent que la multithérapie n’a aucune influence sur les charges EBV PBMC et que la gamme des copies EBV chez les patients recevant et ne recevant pas HAART n’est pas significativement différente En outre, nous avons observé un nombre élevé de copies EBV dans des échantillons de sang patients infectés recevant HAART, ce qui peut expliquer, en partie, les données accumulées de différentes cohortes ne montrant aucune diminution significative de l’incidence de NHL systémique et lymphome de Hodgkin [, -] Une charge EBV élevée dans le sang suggère qu’il y a un nombre accru de lymphocytes B circulants infectés par EBV Cela peut augmenter le risque de prolifération maligne de ces cellules infectées par EBV et le développement ultérieur de certains lymphomes En effet, un modèle de La pathogenèse du lymphome systémique associé à l’EBV Le type de Burkitt pendant l’infection par le VIH postule que ces malignités peuvent résulter de l’infection par EBV et de la transformation des lymphocytes B Cependant, les données longitudinales suggèrent que le taux absolu d’EBV La charge d’EBV dans les PBMC était élevée et présentait une fluctuation considérable au cours du temps chez ces patients, et le niveau absolu d’ADN d’EBV n’était pas lié au nombre de cellules CD ou au VIH-ARN. Ces résultats corroborent les théories selon lesquelles le développement des lymphomes chez les personnes infectées par le VIH est un processus complexe à plusieurs étapes qui n’est pas déterminé uniquement par le VEB adrénergique. La présente étude montre que les charges d ‘ADN EBV dans le sang et la salive ne sont pas corrélées avec le nombre de cellules CD chez les patients infectés par le VIH recevant un traitement HAART. s et confirme les rapports récents [-,] qui n’ont indiqué aucune corrélation claire entre la charge EBV dans les PBMC et les lymphocytes T CD. L’évaluation des réponses des lymphocytes T spécifiques EBV par rapport aux charges d’ADN EBV dans les PBMC plutôt que de mesurer la population totale Récemment, Van Baarle et al ont indiqué que les individus co-infectés par le VIH et l’EBV avaient un faible nombre de cellules CD-T spécifiques du VIH, contrairement à un nombre accru de CD- / CD T spécifiques à l’EBV. Cependant, les patients infectés par le VIH développant un LNH associé à l’EBV présentaient un très faible nombre de lymphocytes T CD- / CD spécifiques à l’EBV. Cette observation suggère que les lymphocytes T CD spécifiques au virus peuvent jouer un rôle dans le contrôle des infections virales chroniques. , parce que les données suggèrent que l ‘efficacité continue de la thérapie antirétrovirale actuelle peut permettre à plus de patients infectés par le VIH de survivre avec une immunosuppression de faible à modérée à long terme, exposant ainsi ces patients au développement de l’ immunodéficience. En conclusion, la présence d’EBV dans le sang de patients infectés par le VIH recevant un traitement antirétroviral hautement actif était significativement associée à une diminution du nombre de cellules CD; cependant, les charges d’ADN EBV dans les échantillons de sang et de salive obtenus chez les patients EBV positifs étaient élevées et non corrélées avec le nombre de cellules CD. Des études futures évaluant la dynamique de l’EBV chez les patients recevant HAART sont nécessaires. est un risque persistant de certains lymphomes liés à l’EBV chez ces personnes