Caractérisation Ex Vivo Des Cellules T Spécifiques Des Cibles Antigéniques Sécrétoires Précoces Sur Les Sites De La Maladie Active Dans La Tuberculose Pleurale

Présence d’une cible antigénique sécrétoire précoce – Les cellules T sécrétant des interférons γ spécifiques au ESAT dans le sang marquent avec précision l’infection tuberculeuse Dans les épanchements pleuraux tuberculeux chez les patients atteints de tuberculose, ces cellules étaient concentrées en moyenne ± déviation standard, ± par rapport à leur niveau dans le sang périphérique P =, et la fonction effectrice rapide affichée Ces cellules étaient absentes chez les patients témoins avec une maladie pleurale non tuberculeuse Le recrutement de cellules T spécifiques ESAT au tissu tuberculeux enflammé démontre leur fonction in vivo et suggère une nouvelle façon de diagnostiquer la pleurite tuberculeuse

esolve sans traitement; Nous avons donc émis l ‘hypothèse que les lymphocytes T CD spécifiques à l’ ESAT pourraient être fortement concentrés dans le liquide pleural. Leur présence pourrait également permettre une nouvelle approche pour le diagnostic rapide de la pleurésie tuberculeuse en attendant les résultats de la culture mycobactérienne. Les épanchements pleuraux et les biopsies révèlent des bacilles acido-résistants en microscopie Nous avons donc utilisé un test ELISPOT immunospot ex vivo enzymatique pour dénombrer les cellules T productrices d’IFN-γ spécifiques des ESAT directement à partir de spécimens provenant de sites de maladie active et simultanément. Patients et méthodes Les patients ont été recrutés à l’hôpital de Northwick Park à Harrow, Londres L’approbation éthique pour l’étude a été obtenue auprès du Harrow Research Ethics Committee numéro de dossier Harrow LREC Neuf patients avaient une tuberculose pleurale, et le patient avait une péritonite tuberculeuse et une tuberculose pleurale chez les femmes et les hommes, l dont étaient séronégatifs; âge moyen ± SD, ± ans Le diagnostic de tuberculose a été confirmé dans tous les cas par culture de M tuberculosis à partir d’échantillons de liquide pleural, d’ascite ou de biopsie pleurale. Un échantillon de sang héparinisé et un échantillon prélevé sur le site de la maladie ont été prélevés de diagnostic; Des échantillons de sang n’étaient pas disponibles chez les patients SD patients ayant une péritonite tuberculeuse et SD chez les patients atteints de tuberculose pleurale Un patient SD avait une tuberculose disséminée, ce qui permettait la collecte d’échantillons pleuraux et ascitiques Huit patients témoins ayant une pleurésie non tuberculeuse un épanchement pleural malin secondaire à un mésothéliome prouvé par biopsie ou un cancer du poumon a également été inclus dans l’étude des femmes et des hommes, tous séronégatifs; âge moyen ± SD, ± ans Ces patients provenaient de régions à faible prévalence de tuberculose, n’avaient aucun antécédent de tuberculose et n’avaient aucun antécédent de contact avec des patients tuberculeux. Le test ELISPOT IFN-γ ex vivo a été réalisé comme décrit ailleurs PBMC ou Des cellules de liquide pleural x cellules par puits ont été ajoutés aux puits dans des ul de milieu complet ESAT recombinant – un don d’Adam Whalen à Veterinary Laboratories Agency Weybridge, Royaume-Uni et des peptides ont été utilisés à des concentrations de μg / mL. p, étaient des acides aminés longs, chevauchés par des résidus, et s’étendaient sur la longueur d’ESAT – Vingt microgrammes par millilitre PPD Statens Seruminstitut; batch RT et μg / mL PHA comme témoin positif ICN Biomedicals ont également été ajoutés à des paires de puits ELISPOT Le test a été développé après h d’incubation Une réponse a été considérée comme positive si le puits de test contenait au moins plus de cellules SFC IFN-γ que le puits témoin négatif, et ce nombre était au moins le double de celui des puits témoins négatifs; le nombre de SFC dans les puits témoins négatifs était toujours ⩽ SFC par puits Après soustraction de la valeur de fond, le nombre de SFC IFN-γ spécifiques pour chaque peptide dérivé de ESAT a été additionné pour donner le nombre total de ESAT spécifiques au peptide. , IFN-γ SFCs pour chaque déplétion immunomagnétique individuelle des cellules T CD et CD à partir de cellules pleurales fluides a été réalisée en utilisant des billes magnétiques Dynabeads; Dynal tel que décrit ailleurs Pour la déplétion CCR, des billes magentiques M de mouton anti-rat recouvertes d’IgG ont été enduites de CCR BD Pharmingen anti-humain purifié de souris et ont été incubées avec des cellules sur de la glace après élimination des cellules CCR-positives. un aimant, les cellules restantes ont été lavées, comptées et mises en place selon les besoins. Ces déplétions ont systématiquement donné des cellules avec une pureté de% -% pour CD et CD et avec une pureté de% -% pour CCR, comme confirmé par analyse avec un trieur de cellules fluorescentes. Bien qu’un nombre significatif de cellules T productrices d’IFN-γ spécifiques des peptides ESAT aient été trouvées dans les PBMC, les patients atteints de tuberculose avaient invariablement un enrichissement de ces cellules dans le liquide pleural n = et le liquide ascitique n = figure a été trouvé dans un échantillon d’ascite fluide SFCs par cellules de liquide ascitique; des concentrations plus faibles ont été trouvées dans le liquide pleural ± SD, ± SFC par cellule pleurale; gamme, – SFC par cellules pleurales liquides; n = et moyenne sanguine ± SD, ± SFC par PBMC; gamme, – SFC par PBMC; n = En revanche, il n’y avait pas de cellules T productrices d’IFN-γ spécifique du peptide ESAT dans les échantillons de liquide pleural provenant de patients non tuberculeux ± SD, ± SFC, gamme, – SFC; n = Un patient contrôle unique avait des cellules T productrices d’IFN-γ spécifiques du peptide par cellules pleurales, une valeur juste supérieure à la valeur seuil pour un résultat positif, à savoir SFC par cellules liquidiennes pluerales Chez les patients atteints de tuberculose, la concentration moyenne ± écart-type des SFC producteurs d’IFN-γ spécifiques de l’antigène dans le liquide pleural était -plus ± supérieur à celui des PBMC P =; n =; l’inclusion du patient avec ascite a augmenté cette valeur à -fold ± -plier P =; n =

Figure View largeTélécharger la diapositive La concentration de la cible antigénique sécrétoire précoces ESAT spécifiques, IFN-γ-produisant des cellules T formatrices de IFN SFC dans le sang n =, liquide pleural n =, et ascite fluide n = spécimens de patients atteints de tuberculose tuberculeuse et pleurale échantillons liquides provenant de patients atteints de pleurite non tuberculeuse NTP n = Ces cellules sont concentrées sur le site de la maladie Le nombre de SFC est indiqué pour chaque échantillon individuel testé Les réponses de paires individuelles d’échantillons provenant du même donneur sont reliées sur le graphique par des lignes. la ligne de base représente des échantillons avec une réponse négative. La concentration de la cible antigénique précoce sécrétoire ESAT spécifique, IFN-γ-produisant des cellules T formatrices d’IFN SFC dans le sang n =, le liquide pleural n =, et le liquide d’ascite n = spécimens de patients atteints de tuberculose tuberculeuse et dans les échantillons de liquide pleural provenant de patients atteints de pleurésie non tuberculeuse NTP n = Ces cellules sont concentrées sur le site de la maladie Le nombre de SFC est indiqué pour chaque échantillon individuel testé. Les réponses de paires individuelles d’échantillons provenant du même donneur sont reliées sur le graphique par des lignes. Les cercles sur la ligne de base représentent des échantillons avec une réponse négative En plus des fréquences plus élevées des cellules T répondantes, le répertoire des épitopes était également plus large sur les sites pathologiques Figure A et B Plusieurs peptides dérivés de l’ESAT étaient reconnus exclusivement dans le liquide pleural et le liquide ascitique des patients Les cellules pleurales reconnaissent un nombre significativement plus élevé de peptides que les PBMCs. cellules fluides, ± peptides [gamme, – peptides]; dans les PBMC, ± peptides [gamme, – peptides]; P = Cependant, aucun peptide n’a été reconnu exclusivement sur le site de la maladie chez tous les patients

après h d’incubation, la sécrétion d’IFN-γ survient à l’intérieur du contact antigène, indiquant une fonction effectrice rapide. Voir les grandes diapositives téléchargeablesA et B, Comparaison des concentrations de la cible antigénique sécrétoire précoce ESAT spécifique, IFN-γ productrices de cellules SFC dans la plèvre PFC et le sang provenant du patient SD A et dans le liquide pleural, le liquide ascitique et le sang du patient SD B montre que les lymphocytes T spécifiques de Mycobacterium tuberculosis ont un répertoire épitopique plus large sur le site de la maladie que dans le sang. Les peptides dérivés de rESAT et d’ESAT p-p ont été testés pour tous les patients Pour SD patient, les échantillons de liquide pleural et sanguin ont été obtenus simultanément, alors que pour le SD patient, l’échantillon de sang a été prélevé plusieurs semaines après prélèvement de liquide ascitique et pleural. fluides C et D, Phénotype des cellules de la plèvre C, Le pourcentage de SFC IFN – γ spécifiques de rESAT par rapport au nombre de SFC IFN – γ obtenus avec des cellules non appauvries. malized to% Dans les cellules non appauvries, le nombre de SFC IFN-γ spécifiques de rESAT pour les patients était le suivant: pour SD patients, SFC par PFC; pour SD patient, SFC par PFC; et pour SD patient, SFC par PFC D, Le nombre total de SFC IFN-γ / cellules positives pour les peptides dérivés de ESAT p, p et p, rESAT-, PPD, et phytohémagglutinine PHA après h et après h d’incubation IFN La sécrétion -γ survient dans h de contact antigène, indiquant la fonction effectrice rapideEn comparant le nombre de cellules T spécifiques ESAT au nombre de cellules T spécifiques PPD dans le liquide pleural des patients patients SD, SD, SD, SD, SD, et SD, le rapport des lymphocytes T spécifiques aux ESAT aux lymphocytes T spécifiques des PPD dans les échantillons de liquide pleural était significativement plus élevé que dans les échantillons de sang appariés en fonction du temps ± SD, ± vs ±; P = Ces données indiquent un recrutement préférentiel de cellules T productrices d ‘IFN – γ spécifiques de l’ ESAT sur le site de la maladie. Épuisement des cellules positives pour CD, CD ou CCR provenant d ‘échantillons de sites pathologiques. La majorité des cellules T productrices d’IFN-y sur les sites pathologiques sont CD positives, et une forte proportion semble être négative. C En outre, ces cellules sont capables de libérer l’IFN-γ au bout de h après le contact avec l’antigène DDiscussion Compartimentation de l’antigène- Des cellules T spécifiques dans le liquide pleural ont été démontrées précédemment, avec l’utilisation de méthodes qui reposent sur l’expansion in vitro par stimulation antigénique sur plusieurs jours, avec des tests de prolifération et par la mesure des cytokines des surnageants de culture test ELISPOT vivo que nous avons utilisé directement quantifie les cellules T effectrices spécifiques de l’antigène sans la nécessité d’une expansion in vitro et est rapide et pratique Utilisation de ce test ex vivo avec des lymphocytes T provenant de sites pathologiques et de sang périphérique, nous avons trouvé que les cellules T productrices d ‘IFN – γ spécifiques de l’ ESAT étaient fortement concentrées dans le liquide pleural tuberculeux, et que ces cellules reconnaissent un répertoire plus large de peptides dérivés d ‘ESAT. cellules provenant du sang périphérique Ces cellules T étaient CD positives, et une proportion élevée étaient négatives au CCR. Les cellules étaient capables de libérer IFN-y en h après le contact antigène. Ensemble, ces découvertes montrent que la mémoire effectrice CDT spécifique à ESAT Le recrutement préférentiel de cellules T CDT sécrétant IFN-γ spécifique de l’ESAT sur des sites de bacilles en réplication, ainsi que leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles, suggèrent que ces cellules contribuent à la défense de l’hôte par le confinement de M tuberculose au site de la maladieIl est remarquable que, bien que tous les patients atteints de tuberculose aient eu des cellules T productrices d’IFN-γ spécifiques ESAT dans leur liquide pleural, ces cellules étaient absentes chez les patients témoins de maladie pleurale non tuberculeuse, et la concentration de ces cellules chez le seul patient chez qui ils ont été détectés était très faible, juste au-dessus du seuil pour un résultat positif. Ainsi, dans les échantillons de liquide pleural, présence et concentration d’ESAT – les lymphocytes T spécifiques, détectés par ELISPOT IFN-γ, semblent être un marqueur sensible et spécifique de la tuberculose active Des concentrations accrues d’IFN-γ dans le liquide pleural se sont avérées prometteuses pour le diagnostic de tuberculose présentant un épanchement pleural exsudatif lymphocytaire , bien que ces études n’aient pas établi de spécificité antigénique et aient utilisé un test moins sensible. Comme les résultats sont disponibles le matin après la collecte des échantillons, l’ELISPOT ex vivo pourrait aider à accélérer le diagnostic de tuberculose pleurale et ainsi éviter les retards associés à l’attente. pour la culture de la tuberculose M, la plupart des cas, dans lesquels les bacilles acido-résistants ne sont pas détectables sur microsco direct py des échantillons pleuraux Une validation supplémentaire nécessitera de tester un plus grand nombre de patients atteints de tuberculose et de patients témoins, y compris les patients présentant des épanchements pleuraux non tuberculeux ayant une infection tuberculeuse latente

Remerciements

Nous remercions le personnel clinique et microbiologique de l’Hôpital Northwick Park, en particulier Michael Eddleston, Robert Wall et Robert Davidson, pour leur aide au recrutement et au diagnostic. Nous remercions Helen Durkan d’avoir obtenu des échantillons sanguins de suivi. Nous remercions Peter Barnes et Martina Testeur pour l’examen critique du manuscrit et pour des commentaires utilesSupport financier KAW a été soutenu par la British Lung Foundation, et RJW a été soutenu par un Wellcome Trust Fellowship en science clinique PK et AL sont Wellcome Trust Senior Fellows en sciences cliniquesPotential Conflits d’intérêts AL est un inventeur nommé sur plusieurs brevets relatifs au diagnostic basé sur les cellules T déposé par l’Université d’Oxford L’approbation réglementaire et la commercialisation d’ELISPOT a été entreprise par une entreprise dérivée de l’Université d’Oxford T-SPOT TB, Oxford Immunotec Ltd, Abingdon, Angleterre dans lequel AL est actionnaire et à laquelle il agit en qualité de conseiller scientifique non exécutif Tous les autres auteurs: flics