3-Hydroxy-1-alkyl-2-méthylpyridine-4 (1H) -thiones: Inhibition du facteur de virulence Pseudomonas aeruginosa LasB

L’émergence d’antibiotiques

résistance à presque tous les agents antimicrobiens sur le marché aujourd’hui

est une grande menace pour la santé publique, nécessitant le développement d’alternatives

stratégies antibactériennes. De ces tactiques, le ciblage de la virulence

facteurs a été considéré comme un “ deuxième génération ” antibiotique

approach.1 − 3 Les bactéries pathogènes produisent des facteurs de virulence tels

comme molécules d’adhésion, systèmes de sécrétion et autres facteurs toxiques,

y compris les protéases pour améliorer leur capacité à provoquer des maladies et

endommager les tissus de l’hôte.2,3 Important, parce que

les facteurs de virulence ne modifient pas la viabilité, les agents ciblant de tels facteurs

devrait en outre imposer une pression sélective plus faible pour le développement de la résistance.2,3 En outre, comme de nombreux facteurs de virulence sont uniques à un organisme spécifique,

il est peu probable que les médicaments ciblant la virulence aient un impact sur le commensal de l’hôte

flora.2,3 L’efficacité de l’exploration de ces cibles reste

être vu; cependant, les inhibiteurs ciblant la fonction et l’administration des toxines,

la régulation de l’expression de la virulence et l’adhésion ont été rapportées

avec des propriétés anti-infectieuses in vivo prometteuses.2,3Pseudomonas aeruginosa est une bactérie nosocomiale, opportuniste

Bactéries à Gram négatif qui est la cause prédominante de la pneumonie

chez les patients ventilés et l’infection pulmonaire chez les patients atteints de kyste

fibrosis.4 En plus des voies respiratoires

infections, le pathogène provoque également du sang, des oreilles, de la peau, des yeux, des voies urinaires,

et les infections du tractus gastro-intestinal entre autres et est responsable

pour 10 – 15% des infections nosocomiales dans le monde.4,5 Pour favoriser ces manifestations cliniques, P. aeruginosa produit un certain nombre de facteurs de virulence de surface et sécrétés qui

faciliter l’attachement bactérien, la colonisation et l’invasion, et le tissu

les dommages et la production de cytokines, respectivement.4,5

les facteurs de virulence comprennent les flagelles, les pili, les lectines, l’alginate et le lipopolysaccharide,

tandis que les facteurs de virulence extracellulaires comprennent les protéases, les hémolysines,

cytotoxine, pyocyanine, sidérophores et exotoxine A.5 Cet arsenal de facteurs de virulence assure que les infections à P. aeruginosa sont à la fois invasives et toxinogènes.5 Ainsi, en raison de la résistance croissante aux antibiotiques

chez P. aeruginosa, y compris l’identification de

nombreuses souches multi-résistantes, 4 nouvelles

des approches pour s’attaquer à de telles infections sont justifiées.Un facteur de virulence de P. aeruginosa qui a été

montré pour être très toxique pour l’hôte6 est

une métalloprotéase Zn2 +, LasB ou P. aeruginosa élastase, 7 qui est sécrétée par la bactérie

d’une manière dépendante du quorum sensitif.8 En particulier, il a été démontré que LasB provoque des lésions tissulaires

et l’inflammation persistante, dégrader les protéines plasmatiques et promouvoir

invasion et la colonisation parmi d’autres pathologies.6 Pour ce faire, l’enzyme dégrade une grande variété de substrats

y compris l’élastine, la fibrine, les immunoglobulines, les facteurs du complément et

cytokines.6 Important, l’infection par

une souche de P. aeruginosa produisant un mutant, inactive

l’élastase s’est révélée moins virulente que la souche parente dans

modèle d’infection pulmonaire chronique chez les rats.9 En outre,

en ce qui concerne la bactérie elle-même, LasB a été liée à un biofilm

formation10 et essaimage, 11 aidant davantage dans son élusion du système immunitaire de l’hôte.

En conséquence, LasB a été montré pour jouer un rôle dans le développement

de la kératite associée à P. aeruginosa, de la pneumonie

burn infection.6Nos laboratoires

ont investi beaucoup d’efforts dans l’exploration de la modulation

de métalloprotéases pour la santé humaine, comme l’identification de petites molécules

inhibiteurs des neurotoxines botuliques, 12 et 22, et des métalloprotéinases matricielles.21,22 Pour ce faire, nous avons conçu et développé des petites molécules non peptidiques.

contenant une variété d’ogives chélatrices de métaux en tant qu’inhibiteurs de site actif.

Étant donné que seuls les inhibiteurs de LasB à base de peptides ont déjà été rapportés23 et associés à la signification thérapeutique potentielle de ce facteur de virulence de P. aeruginosa, nous étions intéressés à étendre

la portée de nos stratégies de conception de ciblage métalloprotéase vers

l’objectif d’identifier de puissants antagonistes LasB à petites molécules. Ici,

nous décrivons nos efforts pour découvrir la première petite molécule non peptidique

inhibiteurs de LasB et valider le rôle de ce facteur de virulence

en essaimage, un comportement bactérien multicellulaire récemment lié à

phénotypes résistants aux antimicrobiens.27Pour amorcer nos efforts de dépistage, nous avons examiné un petit échantillon de 323

bibliothèque d’acide hydroxamique de molécule, qui a été construit en utilisant en phase solide

synthèse organique et à l’origine utilisé pour identifier les inhibiteurs de la

neurotoxine botulique A protéase.14 Tous

composés ont été analysés pour l’inhibition de LasB en utilisant un rapport précédemment rapporté

test de fluorescence basé sur une résonance de fluorescence LasB-cleavable

substrat de peptide transfert d’énergie (FRET) (voir les informations de support pour les détails du test) .23 Les membres de la bibliothèque ont été initialement examinés à 50 μ M,

et de nos efforts de dépistage, huit coups montrant 100% d’inhibition

à cette concentration ont été identifiés après des expériences en triple

(voir les informations de support). Parmi ceux-ci

frapper les composés, seulement deux antagonistes démontrés de LasB dépendant de la dose,

acides hydroxamique 1 et 2 (Figure 1) (Figure 1), avec des valeurs IC50 mesurées de 13,6

et 16,4 μ M, respectivement. Malgré l’activité in vitro de

ces composés, malheureusement, pas d’antagonisme dans les essais de LasB bactériennes

a été observé. Une explication possible du manque de cellules bactériennes

l’activité est la décharge enzymatique du fragment hydroxamate, comme ceci

motif chélatant est connu pour être instable.28Figure 1Hydroxamic

l’acide LasB atteint les valeurs IC50. En raison de l’instabilité potentielle et de la non-cible

les effets de

le groupe hydroxamate, 28 nous étions impatients

pour explorer d’autres motifs de chélation Zn2 ​​+ qui peuvent être

plus stable dans des conditions biologiques. Récemment, une bibliothèque de métal

les fragments chélatants (CFL-1.1) ont été conçus par le laboratoire de Cohen.21,22 La bibliothèque se compose de 96 chélateurs de fragments contenant chacun 2 – 4

atomes donneurs pour la liaison au métal. Quelques membres de la bibliothèque représentative

comprennent les acides picoliniques, les hydroxyquinolones, les pyrimidines et les hydroxypyrones

en plus d’autres unités de liaison des métaux bien connues telles que les sulfamides

et les acides hydroxamiques. Les membres de cette bibliothèque de fragments ont été projetés

à 1 mM pour l’inhibition de LasB, et 11 coups de fragment ont été identifiés

(voir les informations de support). Parmi ceux-ci

composés, quatre ont montré une inhibition dose-dépendante de LasB avec des valeurs de CI50 allant de 80 à 400 ° C (composés 3 – 6, figure ​ figure 2).

Fait intéressant, 2).

Fait intéressant, tous les hits contenaient un ensemble donneur d’atomes O et S et avaient précédemment

ont été identifiés à partir de cette banque en tant qu’inhibiteurs d’autres métalloprotéases Zn2 +. 19 − 22Figure 2Hit

composés de CFL-1.1 avec des valeurs IC50 pour LasB

inhibition.Pour identifier la 3,4-HOPTO [3-hydroxy-1-alkyl-2-méthylpyridine-4 (1H) -thione; 3 – 5] dérivés

avec une puissance in vitro améliorée contre LasB, une sous-banque de composés

basé sur les fragments 3 et 4 (voir les informations de support pour les structures), a été examiné.21 Les analogues 3,4-HOPTO 8 ont été construits

par une condensation en une étape d’une amine primaire avec du thiomaltol 7 (Schéma 1) 21 et initialement testée pour l’inhibition à 100 ° C; De cette sous-bibliothèque,

deux composés ont été découverts avec ∼ amélioration de 30 fois

puissance: analogues 8a et 8b exposés mesurés

Valeurs IC50 de 3,34 et 2,73 μ M, respectivement (Tableau 1, voir les informations de support pour l’activité des autres membres de la sous-bibliothèque). Structure – activité

études de relation ont ensuite été menées sur 8b en variant

les substituants du cycle biphényle; cependant, aucun composé avec

l’inhibition accrue de LasB a été identifiée (Tableau 1). Sur la base des études d’amarrage initial, nous émettons l’hypothèse que

diminution de l’activité des composés 8c – g peut être due à la géométrie restrictive du complexe 3,4-HOPTO – Zn2 +, qui force la chaîne latérale du biphényle à se dissoudre

l’espace comme le site actif de LasB est assez ouvert semblable à celui de

thermolysine (données non présentées) .23Série 1Synthèse

des analogues de 3,4-HOPTOTableaux 1Structures et valeurs IC50

pour Hits Analogues de 3,4-HOPTO Avec l’activité in vitro des analogues de 3,4-HOPTO 8a et 8b confirmés, nous étions alors anxieux de

examiner leur

l’activité dans un essai phénotypique bactérien, en particulier puisque les hydroxamates 1 et 2 n’ont présenté aucune inhibition de LasB sécrétée.

Chez P. aeruginosa, il a été démontré que LasB était

nécessaires à la fois pour l’essaimage et la formation de biofilms, et les mutants lasB ont montré de forts défauts d’essaimage et un ∼ 50%

diminution de la formation de biofilm.11 Essaimage

et la formation de biofilms sont des phénomènes sociaux qui nécessitent une différenciation

cellules et sont régulés par la communication de cellule à cellule, en particulier,

quorum sensing.27 D’importance, à la fois

les états de cellules bactériennes se sont révélés très résistants aux antibiotiques,

et il a été récemment émis l’hypothèse que la résistance aux antimicrobiens

est une caractéristique générale de la multicellularité bactérienne27. Comme l’étude de la motilité d’essaimage est considérée comme utile

modèle pour étudier la résistance aux antibiotiques dans les biofilms, 27 en particulier en raison de problèmes de reproductibilité

souvent non déclarés dans les tests de biofilm, nous avons choisi d’enquêter sur l’essaimage

l’inhibition en présence des composés 8a et 8b.Pour examiner l’effet des composés 8a et 8b sur l’essaimage, la souche de P. aeruginosa

PA14 a été cultivé

sur des boîtes de gélose contenant 25 μ M 8a ou 8b (∼ 95% de viabilité à cette concentration, voir les informations de support) pendant 16 h à 30 °

Comme le montre la Figure 33, les deux 8a et 8b ont presque complètement aboli l’essaimage à cette concentration.

par rapport à un échantillon témoin traité au DMSO qui présentait un caractère dendritique

phénotype essaimage typique de P. aeruginosa. Nous soulignons

ce résultat que 8a et 8b sont les premiers visés

composés pour montrer l’antagonisme d’essaimage. Auparavant, seule virulence générale

l’expression factorielle29,30 et les inhibiteurs d’adhésion bactériens31 ont été examinés dans des essais d’essaimage. Similaire

à la formation de biofilm, l’essaimage est également d’importance pathologique,

comme l’environnement requis pour la motilité de l’essaim est similaire à celle

couvrant les surfaces épithéliales et le mucus hyperabondant trouvé le

dans les poumons des patients atteints de fibrose kystique.11 Ainsi, nous espérons que ces composés seront utiles dans la suite

comprendre le rôle que LasB joue non seulement dans l’essaimage, mais aussi

le développement de la résistance aux antibiotiques dans les essaims de P. aeruginosa et l’invasion et la colonisation des tissus par P. aeruginosa6.

amélioration de la puissance, nous sommes également intéressés à explorer l’applicabilité

de nos inhibiteurs de LasB à petites molécules non peptidiques dans des modèles animaux

d’infection à P. aeruginosa pour étudier l’impact de

cette métalloprotéase dans la promotion de la virulence bactérienne. Surtout,

Il a déjà été démontré que les dérivés de 3,4-HOPTO

non toxique à des concentrations allant jusqu’à 100 μ M dans les cellules de mammifères.32,33 Nous prévoyons qu’une combinaison de petites molécules d’inhibiteurs de LasB

avec des antibiotiques traditionnels peut représenter une nouvelle thérapie pour le ciblage

P. aeruginosa résistant à plusieurs médicaments.Figure 3Chauffage de P.

aeruginosa souche PA14 en présence

de 25 μ M (a) DMSO (contrôle), (b) 8a (gauche), ou 8b (droite). Enfin, nous souhaitons mettre en lumière que bien que

les acides hydroxamique 1 et 2 étaient seulement 5 fois plus

moins puissant

que les analogues 3,4-HOPTO 8a et 8b dans le

test LasB in vitro, ces composés n’ont montré aucune inhibition de l’essaimage

(données non montrées). Comme indiqué, il est tout à fait possible que l’instabilité

et les effets hors cible peuvent être en jeu, comme le soulignent les autres 28, mais il reste à voir si d’autres facteurs

sont impliqués tels que le métabolisme cellulaire bactérien. Stabilité initiale

des études dans un milieu de culture bactérienne indiquent l’instabilité hydrolytique

de 1 et 2 par rapport à 8a et 8b, qui ne présentaient aucune S-oxydation ou décomposition détectable

sur une période de 48 h (voir les informations de support). Peu importe, les composés 1 et 2 serviront

comme échafaudages utiles pour la future ogive “ hopping ” expériences,

et ces études seront rapportées en temps voulu. En conclusion,

nous avons identifié une petite molécule, inhibiteurs de chélation Zn2 ​​+

de LasB avec une activité anti-réchauffement. Ces inhibiteurs

ont été identifiés par criblage initial d’une banque de fragments de chélateur,

valider davantage cette approche pour l’identification de la métalloprotéine

les inhibiteurs. Bien que les composés 8a et 8b ne soient pas les inhibiteurs de LasB les plus puissants à ce jour, ils sont

les premiers antagonistes de petites molécules non peptidiques ont été découverts26. De plus, ils sont les premiers composés ciblés.

présenter une inhibition de l’essaimage. Sur la base de nos conclusions préliminaires

décrites ici, les sondes chimiques ciblées par LasB devraient aider à élucider

le rôle de LasB dans les infections liées à P. aeruginosa

et sa capacité à résister aux antibiotiques. De plus, la découverte

et l’étude de ces petites molécules inhibiteurs du facteur de virulence sera

fournir des preuves supplémentaires pour discerner l’impact du ciblage bactérien

facteurs de virulence en tant que “ deuxième génération ” antibiotique

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